SOCS1調(diào)控JAK/STAT通路傳導(dǎo)抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的機(jī)制研究

鄧楨，雷釗，朱紅偉，李志強(qiáng)，余梟，楊智，孫吉春，金曉馨

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院肝膽胰外科， 湖南長沙 410013； 2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，湖南長沙 410008；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院胃腸外科，湖南長沙 410011)

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的致命惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新增肝癌患者905 677例，死亡病例830 180例[1]。肝癌具有隱匿性，患者發(fā)病時(shí)通常被診斷為肝癌晚期，由于侵襲性較強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高，導(dǎo)致其預(yù)后不良，目前對(duì)于肝癌患者，早期治療以根治性切除為主，但50%的術(shù)后患者在5年內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2-3]。近年來，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressors of cytokine signalling， SOCS)表達(dá)變化被報(bào)道與多種疾病和癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。SOCS家族重要成員SOCS1基因可由多種細(xì)胞因子和生長因子誘導(dǎo)，并以負(fù)反饋方式抑制其信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[5-6]。有研究表明SOCS1基因在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，且SOCS1在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表達(dá)具有獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值[7-8]，然而SOCS1在肝癌進(jìn)展中的功能及分子機(jī)制尚未明確。本研究旨在探討SOCS1表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并初步揭示SOCS1在抑制肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，希望在探討SOCS1抑制肝癌進(jìn)展機(jī)制的同時(shí)，能夠?yàn)榕R床治療肝癌尋找新的分子靶標(biāo)和治療靶點(diǎn)提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購置于美國Thermo Fisher Scientific公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司。RNA提取試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA試劑盒購自上海碧云天公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司。Anti-SOCS1(ab)、Anti-JAK2(ab108596)、Anti-p-JAK2(ab32101)、Anti-STAT3(109085)、Anti-p-STAT3(ab76315)、GADPH抗體、羊抗、兔二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人正常肝細(xì)胞HL-7702購自美國生物資源保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)；肝癌細(xì)胞系HepG2和Hep3B購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫； HuH-7細(xì)胞系購自日本科研生物資源細(xì)胞庫。使用添加100 U/ml鏈霉素/青霉素和10%(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，溫度37℃，含5% CO2環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞。由上海吉瑪公司合成pcDNA3.1-SOCS1，pcDNA3.1-siRNA-SOCS1實(shí)現(xiàn)SOCS1的過表達(dá)或干擾表達(dá)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×105個(gè)/ml，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液培養(yǎng)， 待貼壁后48 h加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 μl，孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加150 μl的DMSO，振蕩10 min；檢測(cè)波長490 nm下的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

1.4 RNA提取及qRT-PCR分析

選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，使用RNase free PBS洗滌，加入Trizol溶液，室溫放置5 min使細(xì)胞充分裂解，12 000 rpm、4℃離心10 min，取澄清上清液，加入三氯甲烷室溫靜置3～5 min，4℃下12 000 rpm離心15 min，取上清液加入異丙醇，室溫靜置10 min后4℃下12 000 rpm離心10 min，75%乙醇洗滌2次，提取細(xì)胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過SYBR green qRT-PCR試劑盒檢測(cè)SOCS1，JAK2和STAT3的mRNA水平，qRT-PCR分析采用7500HT qRT-PCR系統(tǒng)。

1.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，轉(zhuǎn)速13 000 rpm 4℃，離心30 min，取上清液提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，然后100℃水中煮5 min使蛋白變性。放置冰上3 min，13 000 rpm，4℃離心15 min。12%SDS-PAGE濃縮膠進(jìn)行蛋白分離，電泳結(jié)束后，將膠中的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，加含5%(w/v) 脫脂奶粉的TBS/T封閉緩沖液， 搖床封閉2 h?；厥辗忾]液加入相應(yīng)一抗(4℃孵育過夜)，然后使用TBST沖洗膜后加入二抗，最后進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶顯色檢測(cè)。使用GAPDH作為內(nèi)源性對(duì)照。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將各組細(xì)胞以濃度為5×105個(gè)/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，第二天使用槍頭在每個(gè)孔上劃出一條直線，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。在0 h，24 h和48 h時(shí)取樣拍照，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移距離。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300 μl預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫靜置15～30 min，使基質(zhì)膠再水化，再吸去剩余培養(yǎng)液。 使用胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105，取細(xì)胞懸液100 μl加入Transwell小室，常規(guī)培養(yǎng)48 h，使用結(jié)晶紫染色20 min后，輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，檢測(cè)穿過的細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 SOCS1在肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)

收集和培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞HL-7702和肝癌細(xì)胞系HepG2，HuH7，Hep3B， qRT-PCR和Western blot檢測(cè)SOCS1在各細(xì)胞系中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖1所示，相較于人正常肝細(xì)胞HL-7702，SOCS1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在肝癌細(xì)胞系HepG2、HuH7、Hep3B中均顯著下調(diào)(P<0.01)，其中HepG2下調(diào)最為顯著(見圖1)。

圖1 SOCS1在人肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)(A，qRT-PCR檢測(cè)人正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中SOCS1 mRNA表 達(dá)水平； B， Western blot檢測(cè)人正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中SOCS1蛋白表達(dá)水平， ** P<0.01)

2.2 SOCS1抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲

通過pcDNA-SOCS1和pcDNA-si-SOCS1及空載體對(duì)照轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，構(gòu)建SOCS1過表達(dá)和干擾表達(dá)的肝癌細(xì)胞系，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示SOCS1過表達(dá)可顯著降低肝癌細(xì)胞增殖活性，而SOCS1干擾表達(dá)則顯著增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性(P<0.01)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SOCS1過表達(dá)組肝癌細(xì)胞24 h、48 h遷移距離顯著降低，且1/2劃痕愈合時(shí)間增長，而SOCS1干擾表達(dá)組24 h、48 h遷移距離顯著上升，1/2劃痕愈合時(shí)間縮短(P<0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SOCS1過表達(dá)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞侵襲，SOCS1干擾表達(dá)則顯著促進(jìn)細(xì)胞侵襲(P<0.01)(見圖2)。

圖2 SOCS1抑制肝癌細(xì)胞增殖、 遷移和侵襲(A， qRT-PCR和Western blot檢測(cè)SOCS1過表達(dá)/干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效 率； B， MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞增殖活性的影響； C, 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì) 肝癌細(xì)胞遷移能力的影響； D， transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響，** P<0.01)

2.3 SOCS1通過影響JAK2和STAT3磷酸化水平調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路活性

進(jìn)一步檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的影響，結(jié)果如圖3。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示SOCS1干擾表達(dá)或過表達(dá)后肝癌HepG2細(xì)胞中JAK/STAT通路相關(guān)蛋白JAK2和STAT3 mRNA均無顯著變化。Western blot檢測(cè)JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平，結(jié)果顯示SOCS1表達(dá)變化不影響JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平，磷酸化水平檢測(cè)結(jié)果顯示SOCS1干擾表達(dá)可顯著上調(diào)JAK2和STAT3磷酸化水平，而SOCS1過表達(dá)顯著下調(diào)JAK2和STAT3磷酸化水平，表明SOCS1能夠影響肝癌細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路的活性。

圖3 SOCS1調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路活性 (A， qRT-PCR檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì)JAK2mRNA水 平的影響； B， qRT-PCR檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì)STAT3 mRNA水平的影響； C， Western blot 檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì)JAK2、 STAT3蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平的影響， ** P<0.01)

2.4 SOCS1通過調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

SOCS1和JAK/STAT通路抑制劑氯硝柳胺共處理肝癌細(xì)胞HepG2，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾SOCS1表達(dá)后細(xì)胞增殖活性顯著上升， 而氯硝柳胺處理則能抑制SOCS1干擾表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響(P<0.01)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示si-SOCS1和氯硝柳胺共處理組肝癌細(xì)胞遷移速度顯著下降，1/2劃痕愈合時(shí)間顯著增加(P<0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明si-SOCS1和氯硝柳胺共處理能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞侵襲能力(P<0.01)。以上結(jié)果提示，SOCS1能夠通過調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞生長。

圖4 SOCS1通過調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞的生長 (A， MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-SOCS1和JAK/STAT通路抑制劑細(xì)胞增殖活性的影響； B， 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-SOCS1和氯硝柳胺共處理對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響；C， transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞si-SOCS1和氯硝柳胺共處理對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響，**P<0.01)

3 討 論

肝癌是全球面臨的一個(gè)重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，嚴(yán)重威脅人類生命健康，在所有肝癌病例中，90%患者為HCC。目前，肝癌的治療主要以根治性切除、化療及免疫治療為主，然而療效均不理想，且預(yù)后較差[2,9]。因此，尋找新的分子靶標(biāo)和治療靶點(diǎn)，開發(fā)新的靶向治療特效藥物及治療方法是目前亟待解決的問題。

研究表明，SOCS家族與多種癌癥和腫瘤進(jìn)展相關(guān)，特別是SOCS1和SOCS3[10]。鑒于SOCS1在多種癌癥中的低表達(dá)，在癌組織中檢測(cè)SOCS1蛋白表達(dá)水平是評(píng)估SOCS1作為潛在癌癥生物標(biāo)記物的直接方法。本研究檢測(cè)SOCS1在人正常肝細(xì)胞和各種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示SOCS1在3種肝癌細(xì)胞系中均顯著低表達(dá)，結(jié)果與先前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。SOCS1被發(fā)現(xiàn)與多種疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，如，前列腺切除樣本中SOCS1蛋白表達(dá)變化可能和前列腺癌預(yù)后相關(guān)，并且SOCS1可能作為與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的血清生物標(biāo)志物，成為前列腺癌個(gè)性化治療的靶點(diǎn)[11]；卵巢癌中SOCS1 mRNA的低甲基化率增加了SOCS1 mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[12]；SOCS1可通過抑制Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)通路促進(jìn)糖尿病性腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎損傷修復(fù)[13]等。SOCS1基因可能成為未來腫瘤治療的新靶點(diǎn)，為腫瘤治療和預(yù)后評(píng)價(jià)提供新的希望，然而SOCS1在肝癌中作用機(jī)制的研究報(bào)道較少，且都局限于SOCS1在病灶組織中的表達(dá)檢測(cè)及其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，如，丙型肝炎病毒(hepatitic C virus, HCV)患者SOCS1基因表達(dá)與血紅蛋白(hemoglobin, Hb)和血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，而與白細(xì)胞數(shù)與其表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)[14]；SOCS1基因甲基化狀態(tài)可能在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，SOCS1結(jié)合血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)可作為HCC診斷和預(yù)后的非侵襲性生物標(biāo)志物[15]。SOCS1是否能對(duì)肝癌細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響，進(jìn)而控制肝癌的進(jìn)展，仍需要通過研究來驗(yàn)證。本研究通過在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)或干擾表達(dá)SOCS1，檢測(cè)SOCS1表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示過表達(dá)SOCS1能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而干擾表達(dá)SOCS1則結(jié)果相反，證實(shí)了SOCS1在肝癌中的抑癌作用。

SOCS1是經(jīng)典的Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號(hào)通路的抑制劑，研究表明SOCS1可以靶向未磷酸化的JAK，SOCS1的激酶抑制區(qū)域可高特異性靶向結(jié)合JAK的底物結(jié)合槽，從而通過阻止JAK的磷酸化來抑制信號(hào)傳導(dǎo)[16]。SOCS1/JAK/STAT途徑也在多種疾病中表現(xiàn)出調(diào)控作用，如，靶向SOCS1可通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路減輕糖尿病患者的腎臟和血管氧化應(yīng)激[17]；抑制SOCS1可促進(jìn)JAK/STAT信號(hào)通路的持續(xù)激活，并啟動(dòng)與增殖和侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)鼻咽癌的惡性進(jìn)展[18]；SOCS1基因甲基化導(dǎo)致SOCS1基因沉默，影響了SOCS1對(duì)下游JAK2/STAT信號(hào)通路的抑制，從而促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞的生長和增殖[19]。雖然目前SOCS1/JAK/STAT途徑在肝癌中作用尚未見報(bào)道，但有研究顯示，Ⅲ型干擾素可通過誘導(dǎo)SOCS1的表達(dá)，延遲和延長JAK/STAT信號(hào)通路的激活，在HCV患者治療中發(fā)揮重要作用[20]。本研究結(jié)果顯示SOCS1能夠通過調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路活性，影響肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示SOCS1介導(dǎo)的JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)控肝癌進(jìn)展的可能性。并且JAK/STAT通路抑制劑處理能夠恢復(fù)SOCS1表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，進(jìn)一步證實(shí)了SOCS1是通過介導(dǎo)JAK/STAT信號(hào)通路影響肝癌細(xì)胞的生長。

綜上所述，本研究表明SOCS1在肝癌中能通過影響JAK2和STAT3磷酸化水平調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路的活性，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為臨床治療肝癌尋找新的分子靶標(biāo)和治療靶點(diǎn)提供新的切入點(diǎn)。