UPLC-MS/MS法檢測(cè)人血漿中地塞米松濃度及其臨床應(yīng)用

張佳成，詹達(dá)強(qiáng)，畢重文，袁恒杰

UPLC-MS/MS法檢測(cè)人血漿中地塞米松濃度及其臨床應(yīng)用

張佳成，詹達(dá)強(qiáng)，畢重文，袁恒杰

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052)

采用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用建立人血漿中地塞米松含量的檢測(cè)方法．色譜柱為BEH C18，流動(dòng)相為0.01%甲酸乙腈溶液-0.01%甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.4mL/min，電噴霧正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)．調(diào)諧后，地塞米松定量分析檢測(cè)的離子對(duì)為/393.03 → 237.02．地塞米松在1.28～312.12ng/mL(2＝0.9988)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好；檢測(cè)限和定量下限分別為0.50ng/mL和1.00ng/mL；日內(nèi)精密度和日間精密度RSD均小于10.01%，準(zhǔn)確度為100.65%～107.82%；提取回收率為80.90%～84.32%；基質(zhì)效應(yīng)為102.4%～120.0%；在多種試驗(yàn)條件下，血漿樣品穩(wěn)定性良好，相對(duì)誤差均在±10%之內(nèi)．由患有干燥綜合征的妊娠母親抗SSA/Ro或抗SSB/La抗體陽(yáng)性所引起的免疫性胎兒房室傳導(dǎo)阻滯目前臨床上采用皮質(zhì)類固醇治療，但缺乏與藥物療效及安全性等內(nèi)容有關(guān)的具體數(shù)據(jù)．本方法首次成功用于患有干燥綜合征的妊娠母親口服地塞米松治療免疫性胎兒完全性房室傳導(dǎo)阻滯病例，在新生兒體內(nèi)定性和定量檢測(cè)到DXM原形藥物，分娩后同時(shí)定量檢測(cè)母親及新生兒血漿樣品中地塞米松質(zhì)量濃度分別為25.7ng/mL和5.6ng/mL，比例約為5∶1．本方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、方便快捷，可同時(shí)測(cè)定母親和新生兒血漿中地塞米松的濃度，為臨床治療提供精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為進(jìn)行系統(tǒng)全面的數(shù)據(jù)分析打下基礎(chǔ)，確保患者用藥安全有效．

地塞米松；房室傳導(dǎo)阻滯；超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

胎兒房室傳導(dǎo)阻滯(atrioventricular block，AVB)屬于胎兒緩慢性心律失常．免疫性AVB是其常見(jiàn)類型，此類新生兒死亡率高達(dá)34%[1]．患有干燥綜合征的母親體內(nèi)抗干燥綜合征抗體(Sjogren syndrome type，SS)A/Ro和SSB/La可跨胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)并損害胎兒心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，導(dǎo)致胎兒免疫性AVB[2]．研究表明，皮質(zhì)類固醇可以改善胎兒的心臟血流動(dòng)力學(xué)和傳導(dǎo)系統(tǒng)[3]，給予抗SSA/Ro或抗SSB/La抗體陽(yáng)性母體地塞米松(dexamethasone，DXM)可以改善胎兒不完全AVB[4-6]，降低新生兒完全AVB發(fā)病率[7]．DXM脂溶性高，易通過(guò)胎盤屏障[8]，可用于母體給藥，同時(shí)治療母體及胎兒，臨床上母體口服DXM可用于治療胎兒免疫性AVB[9]．用高效液相色譜法對(duì)支氣管肺發(fā)育不良新生兒進(jìn)行DXM血藥濃度測(cè)定的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，但其服藥方法為對(duì)早產(chǎn)兒直接給藥[10].未見(jiàn)對(duì)母親DXM治療，同時(shí)獲得母親與新生兒血藥濃度相關(guān)性數(shù)據(jù)的研究．

目前，DXM的檢測(cè)方法包括：紫外分光光度?法[11]、高效液相色譜法[12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[13]及高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[14-15]等．本研究旨在采用靈敏度更高的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法同時(shí)定量檢測(cè)母親和新生兒血漿樣品中DXM的濃度，為母親口服DXM、預(yù)防和治療胎兒免疫性AVB提供證據(jù)，為進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)治療、研究及預(yù)測(cè)新生兒發(fā)育奠定基礎(chǔ).

1?材?料

1.1?儀?器

Waters Xevo TQD IVD 液質(zhì)聯(lián)用儀(ESI源)，杭州奧盛儀器有限公司氮吹儀，Thermo Scientific 渦旋儀，Thermo Scientific Legend Micro 21R冷凍高速離心機(jī)(離心半徑為8.6cm)，Thermo Scientific Myspin 6臺(tái)式離心機(jī)(離心半徑為5cm)，Benchtop Cleaners 超聲儀，梅特勒MS105十萬(wàn)分之一天平，密理博Direct 8超純水系統(tǒng)，艾本德移液器(10μL、100μL、200μL、1000μL共4種)．

1.2?藥品與試劑

地塞米松對(duì)照品(批號(hào) ZCP-100129)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲酸(LC-MS級(jí)，批號(hào) A117-50)、乙酸(LC-MS級(jí)，批號(hào) A113-50)、甲醇(LC-MS級(jí)，批號(hào) A456-4)、乙腈(LC-MS級(jí)，批號(hào) A955-4)，均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；乙酸乙酯(HPLC級(jí)，批號(hào)2019.07.10)，購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室所用純水均由密理博Direct 8超純水系統(tǒng)制備；健康人空白血漿由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血庫(kù)提供．

2?方法與結(jié)果

2.1?儲(chǔ)備液和工作液的制備

精密稱定DXM對(duì)照品10mg，置于100mL的容量瓶中，甲醇定容，制備成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液．精密移取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液200μL，甲醇定容至10mL，制得DXM對(duì)照品工作液，DXM的濃度為20μg/mL．儲(chǔ)備液和工作液均存放于－80℃冰箱備用．

2.2?質(zhì)控品的制備

用空白血漿逐級(jí)稀釋DXM對(duì)照品工作液，制得3種濃度的血漿質(zhì)控樣品，分別為100ng/mL、50ng/mL和20ng/mL．

2.3?血漿樣本處理

將500μL血漿樣品移至10mL EP管中，加入250μL醋酸緩沖液(pH＝3)，渦旋數(shù)秒混勻；加入1.5mL乙酸乙酯，渦旋1min，3500r/min離心10min；吸取全部上層有機(jī)相，置于1.5mL EP管中，于氮吹儀下?lián)]干；殘留物加入200μL乙腈和水體積比為1∶1流動(dòng)相溶液，渦流振蕩10min，14000r/min離心10min，取上清液，移置于進(jìn)樣小瓶中備用．

2.4?色譜條件

本實(shí)驗(yàn)采用Waters BEH C18柱(1.7μm，2.1mm×50mm)；柱溫40℃；流動(dòng)相為0.01%甲酸乙腈溶液-0.01%甲酸水溶液(0～1min，20∶80→40∶60；1～4min，40∶60→90∶10；4～4.5min，90∶10→10∶90；4.5～4.51min，10∶90→20∶80；4.51～5min，20∶80)；流速為0.4mL/min；進(jìn)樣量10μL；進(jìn)樣室溫度15℃．

2.5?質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)源，毛細(xì)管電壓為3.5kV，離子源溫度為150℃，脫溶劑氣溫度為400℃，脫溶劑氣流速為800L/h，碰撞能量和錐孔電壓分別為21V和23V．檢測(cè)方法為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，正離子模式分通道掃描．調(diào)諧后，DXM定量分析檢測(cè)的離子對(duì)為/393.03→237.02.

2.6?方法學(xué)考察

2.6.1?專屬性

取空白血漿500μL，按第2.3節(jié)方法操作．另配制DXM質(zhì)量濃度為300ng/mL的血漿樣品，按第2.3節(jié)方法操作，考察專屬性．DXM的保留時(shí)間為1.43min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)DXM的測(cè)定不構(gòu)成干擾，結(jié)果如圖1所示．圖1(a)、(b)、(c)中最高色譜峰的響應(yīng)值分別為326、4.89×105、3.41×104，DXM定量分析檢測(cè)的離子對(duì)均為/393.03→237.02.

2.6.2?線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量下限

精密稱取對(duì)照品工作液13μL，加入至820μL的空白血漿中，體外制得833μL血漿樣品．隨后采用逐級(jí)稀釋法連續(xù)5次制備，每次依次取上一級(jí)833μL血漿樣品中的333μL，加入至500μL空白血漿中稀釋，共制得6個(gè)系列梯度質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品．按第2.3節(jié)方法操作，以稀釋后系列梯度質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)()，進(jìn)樣后藥物特征峰的峰面積為縱坐標(biāo)()，加權(quán)(1/2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸后，所得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線．測(cè)量連續(xù)5d，每天建立隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線．標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為：1.28ng/mL、3.2ng/mL、8ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、125ng/mL、312.12ng/mL)．DXM的回歸方程為＝105.73＋44.223，2＝0.9988．DXM的線性范圍是1.28～312.12ng/mL．

將DXM標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入空白血漿，充分混勻并逐步稀釋．DXM的檢測(cè)限和定量下限分別為0.50ng/mL(/＝3∶1時(shí)的濃度)和1.00ng/mL?(/＝10∶1時(shí)的濃度)．

2.6.3?準(zhǔn)確度和精密度

取空白血漿，配制DXM的高、中、低質(zhì)量濃度分別為100ng/mL、50ng/mL和20ng/mL的質(zhì)控樣品，按第2.3節(jié)方法操作．每天測(cè)定這一梯度的質(zhì)量濃度5份，連續(xù)5d．準(zhǔn)確度與精密度以每日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的質(zhì)量濃度與配制的質(zhì)量濃度對(duì)比得出．準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果見(jiàn)表1．

表1?人血漿中DXM的準(zhǔn)確度和精密度

Tab.1 Accuracy and precision of DXM in human plasma

2.6.4?提取回收率

質(zhì)控樣品的配置方法：取空白血漿，配制DXM的高、中、低3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按第2.3節(jié)方法操作，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3批同日測(cè)定．對(duì)照品溶液的配制方法：取空白血漿500μL，經(jīng)液液萃取的空白血漿提取液，制備成質(zhì)量濃度為100ng/mL、50ng/mL和20ng/mL高、中、低3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3批進(jìn)行同日測(cè)定．比較質(zhì)控樣品與質(zhì)控對(duì)照品溶液的色譜峰面積，用于計(jì)算提取回收率．DXM的高、中、低3種濃度的提取回收率分別為84.32%、82.18%和80.90%，見(jiàn)表2.

表2?人血漿中DXM的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)因子

Tab.2 Extraction recovery and matrix effector of DXM in human plasma

2.6.5?基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿，以和樣品制備相同的方式進(jìn)行處理．液液萃取后，離心取上清液，將與配制質(zhì)控血漿樣品所需加入的等份對(duì)照品工作液，加入到上清液中；并將混合物渦旋1min，然后進(jìn)樣分析，制備5個(gè)重復(fù)樣品并分析質(zhì)控濃度基質(zhì)效應(yīng)．通過(guò)比較從加入對(duì)照品工作液的空白血漿提取物與相同濃度的對(duì)照品溶液的峰面積響應(yīng)，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)因子，評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)．DXM的基質(zhì)效應(yīng)因子在高、中、低3種濃度分別為102.4%、113.2%和120.0%，見(jiàn)表2．

2.6.6?穩(wěn)定性

分別考察血漿樣品室溫放置4h、提取處理后進(jìn)樣器(10℃)放置24h、反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性．每一項(xiàng)穩(wěn)定性考察時(shí)，按第2.2節(jié)方法配制高、低兩個(gè)質(zhì)量濃度(100ng/mL和20ng/mL)的質(zhì)控樣品各5份，按第2.3節(jié)方法制備后，進(jìn)樣分析，并與相應(yīng)新配制的質(zhì)控樣品比較．結(jié)果顯示，血漿樣品在室溫放置4h穩(wěn)定，提取處理后進(jìn)樣器(10℃)放置24h穩(wěn)定，4℃冰箱放置24h穩(wěn)定，－20℃冰箱放置36d穩(wěn)定，相對(duì)誤差均在±10%之內(nèi)，見(jiàn)表3．

表3?在不同處理?xiàng)l件下DXM的穩(wěn)定性

Tab.3?Stability of DXM under different treatment conditions

3?臨床應(yīng)用實(shí)例

患者，女，33歲，主因“孕2產(chǎn)0孕37＋2周，血壓升高10周，胎兒發(fā)育小6周”入院治療．既往“干燥綜合征”2＋年，現(xiàn)口服DXM 4.5mg QD控制可．3年前，孕27＋周因“胎兒完全性房室傳導(dǎo)阻滯”行引產(chǎn)一次，未避孕．“胎兒生長(zhǎng)受限，妊娠期高血壓”于腰硬聯(lián)合麻醉下行子宮下段橫切口剖宮產(chǎn)術(shù)＋雙側(cè)子宮動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，術(shù)中剖娩1活嬰，體重2400g，身長(zhǎng)47cm，Apgar評(píng)分9′-10′-10′．分別取母親和新生兒靜脈血3mL，按第2.3節(jié)方法操作．測(cè)定DXM，母親和新生兒的血漿樣品中地塞米松質(zhì)量濃度分別為25.7ng/mL和5.6ng/mL，比例約為5∶1．

4?討?論

本研究采用UPLC-MS/MS定量檢測(cè)新生兒血漿樣品中DXM的濃度．該方法可有效減少樣品前處理時(shí)間和分析成本，提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度；與其他方法，如高效液相色譜法[12]相比，該方法檢測(cè)限更低．本方法可同時(shí)檢測(cè)母親及AVB新生兒DXM血藥濃度，簡(jiǎn)單高效，便于分析研究．同時(shí)，該檢測(cè)分析時(shí)間短，取血量少，對(duì)新生兒創(chuàng)傷小，能夠更好地滿足日常監(jiān)測(cè)的要求．該方法流動(dòng)相不含緩沖鹽，對(duì)色譜柱損害較小．在血漿樣品處理過(guò)程中，本研究采用液液萃取法(liquid-liquid extraction，LLE)來(lái)減少檢測(cè)過(guò)程中的殘留雜質(zhì)．

近年來(lái)，生物樣本中的地塞米松檢測(cè)為特定疾病的診斷與治療提供清晰準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支撐，如檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤患者的血清樣本中的DXM[16]，通過(guò)檢測(cè)眼房水中DXM含量治療多種眼部疾病[17]，以及通過(guò)監(jiān)測(cè)人角化細(xì)胞中地塞米松濃度變化來(lái)確定藥物間相互作用[18]．本病例中患病母親抗SSA/Ro抗體陽(yáng)性，曾經(jīng)分娩過(guò)AVB胎兒，再次妊娠孕娩AVB胎兒的發(fā)生率高達(dá)12%～20%[19]．該患者在妊娠期每日單次口服DXM，新生兒預(yù)后良好，生長(zhǎng)發(fā)育正常．以往文獻(xiàn)中僅報(bào)道DXM可以通過(guò)胎盤[8, 20]，本研究首次采用 UPLC-MS/MS 于妊娠母親給藥后定量檢測(cè)分娩新生兒體內(nèi)的DXM濃度，獲得了母體及新生兒的DXM血藥濃度的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)．通過(guò)同類病例的后續(xù)隨訪，本方法將進(jìn)一步積累相關(guān)數(shù)據(jù)，探究二者比例關(guān)系，建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而通過(guò)母親血藥濃度預(yù)測(cè)AVB胎兒血藥濃度，為臨床實(shí)踐中確定妊娠母親DXM給藥劑量、胎兒AVB預(yù)防效果以及探討DXM濃度與新生兒未來(lái)發(fā)育的聯(lián)系提供準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)支持，確?；颊哂盟幇踩行В?/p>

5?結(jié)?語(yǔ)

本方法首次成功用于患有干燥綜合征的妊娠母親口服地塞米松治療免疫性胎兒完全性房室傳導(dǎo)阻滯病例，在新生兒體內(nèi)定性和定量檢測(cè)到DXM原形藥物，靈敏度高、準(zhǔn)確性好、方便快捷．本方法同時(shí)測(cè)定母親和新生兒血漿中地塞米松的濃度，二者的比例關(guān)系為5∶1．

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Determination of Dexamethasone in Human Plasma by UPLC-MS/MS and Its Clinical Application

Zhang Jiacheng，Zhan Daqiang，Bi Chongwen，Yuan Hengjie

(General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China)

We aimed to develop an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)method to determine the concentration of dexamethasone (DXM)in human plasma. The column was an ethylene bridged hybrid C18eluted with a gradient of 0.01% formic acid in acetonitrile-0.01% formic acid in water as the mobile phase at a flow rate of 0.4mL/min in electrospray ionization positive ion mode with multiple reaction monitoring. After tuning，the ion pair for quantification was DXM：/393.03→237.02. DXM showed a good linear relationship within the range of 1.28～312.12ng/mL(2＝0.9988). The detection limit and lower limit of quantification were 0.50ng/mLand 1.00ng/mL，respectively. Relative standard deviations of intra-day and inter-day precision were ＜10.01%. Accuracy was within the range of 100.65%—107.82%. Extraction recovery was within the range of 80.90%—84.32%. The matrix effects ranged from 102.4% to 120.0%. Plasma samples remained stable before and after treatment under various conditions，with the relative error being within ±10%. Fetal immune mediated atrioventricular block induced by anti-SSA/Ro-positive or anti-SSB/La-positive mothers with Sjogren syndrome were clinically treated with corticosteroids，whereas the effect and security need to be testified. This is the first applied method in cases in which the mother is administered DXM orally. It was found that DXM exists in neonate plasma and that the DXM concentrations of plasma samples of the mother and neonate were 25.7ng/mLand 5.6ng/mL，respectively，with rough ratio being 5∶1.The developed method is sensitive，efficient，and convenient to determine the concentration of DXM in plasma of mother and neonate so as to provide precise data for clinical application.

dexamethasone；atrioventricular block；ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

R917

A

0493-2137(2021)09-0956-06

10.11784/tdxbz202008068

2020-08-26；

2020-10-13.

張佳成（1995—??），男，碩士研究生，zhangjiacheng1995@126.com.

袁恒杰，hengjieyuan@163.com.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81720108015).

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81720108015).

(責(zé)任編輯：田?軍)