瓜子金皂苷己通過SOCS3抑制氧糖剝奪/復(fù)氧所致小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)*

高 燕，付旭陽，賀 帥，高 冰，石瑞麗，4

(1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所；3.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.達(dá)拉特旗人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

腦卒中是常見的急性腦血管類疾病，其中缺血性卒中最為常見，其發(fā)病率、致殘率、致死率都較高，主要的藥物治療方法有溶栓治療、抗凝治療、抗血小板聚集治療、神經(jīng)保護(hù)治療等。其中缺血后通過溶栓盡快恢復(fù)腦血流量是挽救尚未梗死腦組織的有效方法，但恢復(fù)血液灌注后會誘發(fā)更為嚴(yán)重的腦缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion，CIR)損傷。CIR損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)不僅在疾病發(fā)病期起重要作用，影響神經(jīng)功能損害的程度[1]，也與疾病預(yù)后密切相關(guān)。過度和持續(xù)的炎癥反應(yīng)不僅影響腦血管血流，而且可以直接破壞組織結(jié)構(gòu)，造成缺血腦組織損傷。

CIR損傷發(fā)生時(shí)各種炎性細(xì)胞因子均需通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮效應(yīng)，其中Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路與CIR損傷存在密切關(guān)聯(lián)，是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的經(jīng)典途徑[2]。該通路的負(fù)反饋調(diào)控因子細(xì)胞因子信號抑制因子3(Suppressors of cytokine signaling3, SOCS3)在炎癥反應(yīng)中被炎性細(xì)胞因子激活，可通過負(fù)反饋抑制JAK2/STAT3信號通路的激活從而減輕炎癥反應(yīng)。SOCS3作為CIR損傷后的上調(diào)基因，可能參與了損傷后炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)與修復(fù)，也可能參與了腦細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過程，起到內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)的作用。

瓜子金皂苷己(Polygalasaponin F, PGSF)是從遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志屬植物瓜子金中提取的齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中主要用于散郁助眠、益智安神、解毒消腫。有研究發(fā)現(xiàn)PGSF可抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥模型中IL-1β的表達(dá)[3]。本課題組也在該模型中發(fā)現(xiàn)，PGSF可降低一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2的蛋白及mRNA表達(dá)[4]。但PGSF對氧糖剝奪/復(fù)氧(Oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)所致BV-2細(xì)胞激活分泌的作用及其作用機(jī)制，目前尚無報(bào)道。本研究擬在細(xì)胞水平應(yīng)用OGD/R模型誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥，以模擬腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，初步觀察PGSF能否降低炎癥因子的表達(dá)水平，該作用是否與SOCS3表達(dá)相關(guān)。通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確PGSF的體外抗炎機(jī)制，為PGSF的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論線索。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑 胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，TRIZOL試劑購自thermo fisher公司，QPCR試劑盒購自上海海方生物技術(shù)有限公司。

1.2.2儀器 超速低溫冷凍離心機(jī)購自德國eppendorf公司，細(xì)胞缺氧試驗(yàn)培養(yǎng)箱系統(tǒng)購自Billups-Rothenberg公司，熒光定量pCR儀購自ABI公司，酶標(biāo)儀購自thermo fisher公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及OGD/R模型的建立 將細(xì)胞置于含10 %胎牛血清和高糖DMEM的完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞長至70 %～80 %傳代，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將BV-2細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后換為無糖eagle液，置于缺氧裝置中2 h。設(shè)置缺氧裝置氣體流量為20～25 L/min，持續(xù)充氮?dú)? min后將細(xì)胞放入，取出后重新在完全培養(yǎng)基中于正常條件下培養(yǎng)以完成復(fù)氧復(fù)糖，6 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及處理 細(xì)胞分為5組。(1)Control組：將培養(yǎng)基換為含糖eagle+葡萄糖溶液孵育2 h，之后換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h；(2)OGD/R模型組：將培養(yǎng)基換為無糖eagle溶液后放入缺氧裝置中孵育2 h，之后換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h；(3)OGD/R+PGSF-L組：將培養(yǎng)基換為含PGSF(0.1 μmol/L)的無糖eagle溶液置缺氧裝置中2 h，再將孵育液換為含0.1 μmol/L PGSF的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h；(4)OGD/R+PGSF-M組：與OGD/R+PGSF-L組相同處理，PGSF濃度為1.0 μmol/L；(5)OGD/R+PGSF-H組：與OGD/R+PGSF-L組相同處理，PGSF濃度為10.0 μmol/L。

1.3.3QPCR檢測基因表達(dá) 應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)試劑盒說明書進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Quantitative PCR，QPCR)擴(kuò)增cDNA。擴(kuò)增體系：預(yù)變性95 ℃ 10 min、95 ℃ 15s～60 ℃ 60 s循環(huán)40次、溶解曲線75 ℃～95 ℃，每20 s升溫1 ℃。結(jié)果處理采用ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本) - CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)、B=CT(目的基因，對照樣本) - CT(內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本)、K=A-B、表達(dá)倍數(shù)=2-K。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank已發(fā)表的基因序列，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)NKCC1基因的pCR擴(kuò)增引物，并同時(shí)設(shè)計(jì)內(nèi)參β-actin基因擴(kuò)增引物進(jìn)行檢測。引物由上海生工公司合成，序列見表1。

表1 目的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1PGSF對TNF-α基因表達(dá)的影響 與正常對照組比較，OGD/R損傷后模型組BV-2細(xì)胞的TNF-α基因出現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05)；PGSF-L組、PGSF-M組、PGSF-H組TNF-α表達(dá)均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。說明PGSF能夠降低OGD損傷后的TNF-α高表達(dá)，且呈濃度依賴性。見圖1。

圖1 PGSF對TNF-αmRNA表達(dá)的影響

2.2PGSF對IL-1β基因表達(dá)的影響 與正常對照組相比，OGD/R損傷后模型組BV-2細(xì)胞的IL-1β基因表達(dá)明顯升高(P<0.01)；PGSF-L組、PGSF-M組、PGSF-H組IL-1β表達(dá)均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明PGSF能夠降低OGD損傷后的IL-1β高表達(dá)的情況，且呈濃度依賴性。見圖2。

圖2 PGSF 對IL-1β mRNA 表達(dá)的影響

2.3PGSF對IL-6基因表達(dá)的影響 與正常對照組相比，模型組BV-2細(xì)胞的IL-6基因出現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05)；PGSF-L組、PGSF-M組、PGSF-H組IL-6均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果說明PGSF能夠降低OGD損傷后的IL-6高表達(dá)的情況，且呈濃度依賴性。見圖3。

圖3 PGSF對IL-6mRNA 表達(dá)的影響

2.4PGSF對SOCS3基因表達(dá)的影響 與正常對照組相比，模型組BV-2細(xì)胞的SOCS3基因出現(xiàn)高表達(dá)(P<0.01)；PGSF-M組和PGSF-H組SOCS3表達(dá)明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。說明PGSF能夠降低OGD損傷后的SOCS3高表達(dá)，且高劑量最佳。見圖4。

圖4 PGSF對SOCS3mRNA表達(dá)的影響

3 討論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，興奮性毒性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等都會參與，其中，缺血后炎癥反應(yīng)在缺血性疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要的角色。腦組織中主要的免疫應(yīng)答細(xì)胞—小膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦I/R損傷的重要機(jī)制。神經(jīng)損傷后產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、自由基、活性氧等均可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞迅速釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子[5]，放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促炎因子又可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，形成惡性循環(huán)[6]。本研究采用BV-2細(xì)胞制備OGD/R模型，是腦I/R損傷常用的體外缺血模型，能夠很好地模擬神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的I/R損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧處理后BV-2細(xì)胞明顯被激活，細(xì)胞呈球狀“阿米巴樣”，給予PGSF可明顯減輕形態(tài)學(xué)的改變；采用QPCR的方法檢測各組細(xì)胞的炎性因子基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)BV-2細(xì)胞在OGD/R后表達(dá)了大量炎性因子，而PGSF可降低OGD/R處理后的炎性因子基因表達(dá)。說明PGSF能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子。

SOCS3作為細(xì)胞因子信號的負(fù)調(diào)控因子，可被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)生成，同時(shí)又可對相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)，應(yīng)用這種方式維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[7]。在經(jīng)典炎癥相關(guān)的JAK2/STAT3信號通路中，SOCS3本身是STAT3調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物之一，但又能負(fù)反饋抑制JAK2/STAT3信號的級聯(lián)反應(yīng)[8]。本研究預(yù)期給予PGSF干預(yù)可通過促進(jìn)SOCS3表達(dá)抑制炎癥相關(guān)信號通路進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，但是與預(yù)期相反的是，SOCS3的表達(dá)不但沒有上調(diào)反而出現(xiàn)了下降。為了解釋這個(gè)現(xiàn)象我們需要對影響SOCS3表達(dá)的諸多因素進(jìn)行綜合分析。SOCS3可受多種信號通路的調(diào)節(jié)。比如漢黃芩素可以通過PI3K介導(dǎo)的MAPK信號通路激活、AP-1共有序列和STAT響應(yīng)元件的激活誘導(dǎo)SOCS3生成，Toll樣受體激活也誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)。已有研究表明[9]，在LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型中，PGSF是通過調(diào)節(jié)TLR4-PI3K/AKT—NF-κB信號通路減少神經(jīng)炎性細(xì)胞因子的分泌，PGSF可以抑制炎癥模型中TLR4表達(dá)、下調(diào)MAPK信號通路的p38磷酸化水平并抑制NF-κB核移位[10]，而這些分子功能的抑制又可能導(dǎo)致SOCS3表達(dá)水平的降低。提示在PGSF的抗炎作用中，有多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與，這些信號通路之間又存在復(fù)雜的交互作用。

本研究在細(xì)胞分子水平觀察了PGSF在腦I/R損傷中的抗炎癥作用，并發(fā)現(xiàn)PGSF能夠降低SOCS3mRNA的表達(dá)，提示SOCS3相關(guān)信號通路可能介導(dǎo)了PGSF的抗炎作用，為PGSF防治缺血性腦病的研發(fā)工作提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。