瓜子金皂苷己對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠NKCC1及炎癥因子表達(dá)的影響*

孫健淇，付旭陽，張若琛，時(shí)靜華，石瑞麗，5

(1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生理教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院；3.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所；4.包頭市第九中學(xué)；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

缺血性卒中的主要病因?yàn)槟X血管的梗塞，導(dǎo)致腦血流相對(duì)或絕對(duì)的供應(yīng)不足。缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與神經(jīng)炎癥、能量代謝障礙、離子穩(wěn)態(tài)失衡、興奮性毒性、氧化應(yīng)激損傷等因素密切相關(guān)。組織型纖溶酶原激活劑是目前國際公認(rèn)的、唯一獲得美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療急性腦缺血的有效藥物，但由于其嚴(yán)格的時(shí)間窗，僅有約5 %的患者能及時(shí)得到溶栓治療[1]，還有可能面臨溶栓后出血轉(zhuǎn)化。近些年從中草藥中尋找防治腦缺血損傷的活性成分成為研究熱點(diǎn)，丁基苯肽、葛根素等都在臨床工作中發(fā)揮出一定療效[2]。

近年發(fā)現(xiàn)鈉-鉀-氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Na+-K+-2Cl-combined transporter type 1, NKCC1)作為離子膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，再灌注后NKCC1的高表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)元離子動(dòng)態(tài)平衡紊亂，還能使血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)滲透壓增高而發(fā)生水腫，導(dǎo)致細(xì)胞漲亡。細(xì)胞骨架的破壞最終導(dǎo)致血腦屏障的破壞。因此，作為腦缺血再灌注損傷重要的治療靶點(diǎn)，NKCC1的表達(dá)量與疾病愈后密切相關(guān)。

瓜子金皂苷己(Polygalasaponin F, PGSF)是從瓜子金中分離得到的齊墩果烷型三萜皂苷單體，目前國內(nèi)外的研究資料非常有限。本課題組前期在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PGSF能對(duì)抗氧糖剝奪-復(fù)氧所致神經(jīng)細(xì)胞損傷[3]，并且在BV-2細(xì)胞炎癥模型中具有抑制炎癥作用[4]。而神經(jīng)炎癥也與NKCC1的表達(dá)相關(guān)。因此，本研究擬采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌模型(Middle cerebral artery occlusion/Reperfusion, MCAO/R)，在整體水平上觀察PGSF對(duì)腦組織NKCC1和炎性因子基因表達(dá)的影響，反映PGSF對(duì)腦缺血損傷的影響是否與這兩種因素相關(guān)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重220～280克，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量合格證號(hào)(SCXK(京)2019-0010)。動(dòng)物飼養(yǎng)于明暗交替(12 h∶12 h)的清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室中，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度50 %，自由進(jìn)食飲水，術(shù)前12 h禁食水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2分組及給藥 將動(dòng)物隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組，模型組，PGSF低劑量組(0.1 μmol/L)，PGSF中劑量組(1 μmol/L)， PGSF高劑量組(10 μmol/L)。假手術(shù)組及模型組給予溶劑對(duì)照(0.01M PBS)。采用側(cè)腦室立體定位注射給藥，于MACO手術(shù)前1 h注射，注射體積5 μL。

1.3模型制備 腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠，應(yīng)用Longa線栓法制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞動(dòng)物模型，1 h后拔出線栓進(jìn)行再灌注。術(shù)中及術(shù)后維持大鼠肛溫在(37±1) ℃。假手術(shù)組除不插入尼龍魚線外其余操作同模型組。各組大鼠手術(shù)完成之后，放入潔凈飼養(yǎng)籠中，在26 ℃恒溫條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。根據(jù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，各組大鼠在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)評(píng)分、處死、取材。動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)成功標(biāo)準(zhǔn)：①左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失；②倒懸時(shí)左上肢向胸前屈曲；③行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒或向左轉(zhuǎn)圈；④右側(cè)出Honer’s癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：模型制備完后大鼠雖然有腦缺血癥狀，但有下列情況之一者不納入：出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者；鏡下觀察無缺血病理改變者；未到觀察時(shí)間點(diǎn)死亡者。

1.4腦組織樣本準(zhǔn)備 造模24 h后，處死大鼠斷頭取腦，在冰板上剝離腦組織，取病灶側(cè)大腦皮層組織保存于-80 ℃冰箱。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 取大鼠腦組織50 mg，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄提取RNA樣本3 μg，應(yīng)用反轉(zhuǎn)后的cDNA進(jìn)行QPCR。配置反應(yīng)體系，體系中加入cDNA模板(0.3 μg)1 μL、上下游引物各0.5 μL，無酶水8 μL，QPCR Mix 10 μL。擴(kuò)增體系：預(yù)變性95 ℃ 10 min、循環(huán)(40次) 95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、溶解曲線75 ℃～95 ℃，每20 s升溫1 ℃。結(jié)果處理采用ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)、 B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本)、K=A-B、表達(dá)倍數(shù)=2-K。引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank已發(fā)表的基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)NKCC1基因PCR擴(kuò)增引物，同時(shí)設(shè)計(jì)內(nèi)參GAPDH基因擴(kuò)增引物進(jìn)行檢測。引物由上海生工公司合成，序列見表1。

表1 靶基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1應(yīng)用QPCR法檢測大鼠缺血再灌注腦損傷后大腦皮層中NKCC1基因的表達(dá)情況 結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，NKCC1mRNA在缺血再灌注損傷后表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與I/R模型組比較，PGSF高劑量組及中劑量組NKCC1mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而低劑量組與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果說明，PGSF在整體水平能夠降低缺血再灌注腦損傷后NKCC1mRNA的表達(dá)，且中劑量最佳。見圖1。

圖1 PGSF對(duì)NKCC1基因表達(dá)的影響

2.2應(yīng)用QPCR法檢測大鼠缺血再灌注腦損傷后大腦皮層中TNF-α基因的表達(dá)情況 結(jié)果表明，模型組出現(xiàn)了TNF-α的高表達(dá)，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 PGS高劑量組、中劑量組及低劑量組TNF-α表達(dá)均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果說明，PGSF能夠降低腦缺血再灌注損傷后的TNF-α高表達(dá)的情況，且中劑量最佳。見圖2。

2.3應(yīng)用QPCR法檢測大鼠缺血再灌注腦損傷后大腦皮層中IL-1β基因的表達(dá)情況 結(jié)果表明，模型組出現(xiàn)了IL-1β的高表達(dá)，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 PGS高劑量組、中劑量組及低劑量組IL-1β均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果說明，PGSF能夠降低缺血再灌注腦損傷后的IL-1β高表達(dá)的情況，且中劑量最佳。見圖3。

圖2 PGSF對(duì)TNF-α基因表達(dá)的影響

圖3 PGSF對(duì)IL-1β基因表達(dá)的影響

2.4應(yīng)用QPCR法檢測大鼠缺血再灌注腦損傷后大腦皮層中IL-6基因的表達(dá)情況 結(jié)果表明，示模型組出現(xiàn)了IL-6的高表達(dá)，與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 PGS高劑量組、中劑量組及低劑量組IL-6均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果說明，PGSF能夠降低缺血再灌注腦損傷后的IL-6高表達(dá)的情況，且各劑量均有明顯抑制作用。見圖4。

圖4 PGSF對(duì)IL-6基因表達(dá)的影響

3 討論

生理情況下，NKCC1作為重要的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)Na+、K+、Cl-向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)離子穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞體積的調(diào)控起重要作用。NKCC1分布廣泛，在所有的上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，在神經(jīng)系統(tǒng)中，NKCC1表達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，與許多生物過程密切相關(guān)。腦卒中發(fā)生后NKCC1表達(dá)增加，大量Na+被轉(zhuǎn)運(yùn)入胞，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高會(huì)促進(jìn)Na+/Ca2+交換蛋白的反向轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)元凋亡[5]。星形膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的水腫會(huì)破壞細(xì)胞固有骨架結(jié)構(gòu)，由星形膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接構(gòu)成的血腦屏障被破壞，加重腦水腫。NKCC1可作為腦卒中的治療靶點(diǎn)已得到較多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用生姜降低了NKCC1表達(dá)水平，降低了大鼠缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能損傷及梗死面積[6]；參附注射液也可以通過抑制NKCC1起到保護(hù)作用[7]。同樣作為中藥成分，我們的研究也得到了相似的結(jié)果，高劑量和中劑量PGSF能夠下調(diào)NKCC1 mRNA的表達(dá)，提示PGSF抗缺血再灌注損傷作用與下調(diào)NKCC1的基因表達(dá)相關(guān)，為PGSF作為神經(jīng)保護(hù)劑提供了新的理論依據(jù)。

文獻(xiàn)顯示炎性因子與NKCC1的表達(dá)存在一定關(guān)聯(lián)。 TNF-α 或IL-1β可顯著增加原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中NKCC1 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)，炎性因子的濃度變化可導(dǎo)致NKCC1表達(dá)量的變化[8]。近期也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TNF-α 等炎性因子可上調(diào)急性肺損傷小鼠NKCC1的表達(dá)水平[9]；TNF-α 缺陷小鼠的小腦和大腦皮質(zhì)中NKCC1表達(dá)均低于正常，外源性注射TNF-α后其NKCC1表達(dá)水平顯著回[10]，證明炎性因子TNF-α 具有促進(jìn)NKCC1 表達(dá)的作用。為明確PGSF下調(diào)NKCC1表達(dá)是否與炎性因子表達(dá)量有關(guān)，本研究采用qPCR方法檢測了TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高劑量、中劑量及低劑量PGSF在整體水平均明顯降低了炎性因子的表達(dá)量，推測PGSF有可能直接通過抗炎作用改變?nèi)毖俟嘧?duì)腦組織的影響，也有可能間接通過抗炎作用減少NKCC1的表達(dá)量，繼而影響腦組織的形態(tài)和功能。此外，低劑量組大鼠NKCC1表達(dá)量與模型組無顯著差異，而炎性因子卻被明顯下調(diào)，說明PGSF并非僅通過炎癥因子改變NKCC1的表達(dá)，可能還存在其它作用機(jī)制，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究在整體水平驗(yàn)證了PGSF在腦缺血再灌注損傷中的抗炎癥作用，并發(fā)現(xiàn)PGSF能夠降低NKCC1 mRNA的表達(dá)，提示NKCC1有可能作為PGSF的作用靶點(diǎn)，為PGSF防治缺血性腦病的研發(fā)工作提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。