奶牛乳脂合成及其關(guān)鍵基因的調(diào)控作用

焦蓓蕾， 田 茂， 楊春生， 李文敏， 楊愛芳， 王 靜， 賀永強*, 亮 玲

(1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司，內(nèi)蒙古 和林格爾 011500；2.內(nèi)蒙古愛養(yǎng)?？萍加邢薰?，呼和浩特 010000)

牛奶是家庭日常食譜中保健養(yǎng)生的高級營養(yǎng)品，之所以擁有這么優(yōu)秀的飲用價值離不開其豐富的營養(yǎng)成份。乳脂，作為保證乳制品感官品質(zhì)、營養(yǎng)質(zhì)量水平的重要組成之一，其所含的脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)，如：油酸和亞麻酸在抗血管動脈粥樣硬化方面起到了有效的預防作用[1]，在每100 g牛奶中約含3.2 g的脂肪，在人體的消化率高達95%以上。此外，乳脂是人體必需FA、磷脂(phospholipid)以及脂溶性維生素的重要來源[2]，為人體提供大量的營養(yǎng)與能量。

乳脂的主要成分是甘油三酯，由不同種類和數(shù)量的脂肪酸構(gòu)成。長鏈脂肪酸(long-chain fatty acid，LCFA)主要是在血液中轉(zhuǎn)運并被乳腺重新吸收合成；短鏈(short chain fatty acid，SCFA)或中鏈脂肪酸(medium-chain fatty acid，MCFA)是在乳腺內(nèi)從頭合成。通過大量的研究試驗以及理論綜述，發(fā)現(xiàn)影響奶牛乳脂合成的主要因素大致分為4種：飼養(yǎng)管理因素、營養(yǎng)因素[3-4]、遺傳育種因素以及內(nèi)分泌因素。

近年來，功能基因組學的研究強調(diào)了哺乳動物乳腺組織的泌乳復雜性，揭示了泌乳中潛在多個基因及其所形成關(guān)系網(wǎng)絡的轉(zhuǎn)錄作用與調(diào)控機制[5]。通過分子生物學對乳脂合成的深入研究已揭示出在血液中脂肪酸的攝取、細胞內(nèi)脂肪酸活化與通路、脂肪酸的從頭合成與去飽和作用、三?；视秃铣伞⒅文さ男纬傻冗^程中關(guān)鍵基因及其信號通路的調(diào)控作用[6-8](詳見表1)。本文通過對脂肪酸的攝取與轉(zhuǎn)運、脂肪酸的內(nèi)源合成、酮體的利用、三酰甘油和磷脂合成、酯化和脂滴形成等過程中相關(guān)基因的主要功能、激素(基因)的調(diào)控機制進行歸類與綜述性探討，旨在歸納出調(diào)控奶牛乳脂合成的關(guān)鍵基因，為在奶牛的分子水平上影響奶牛乳脂合成的調(diào)控機制提供詳細的理論依據(jù)。

1 乳脂的合成與分泌機理

1.1 乳脂的合成

乳脂的主要組成成分是甘油三酯(triacylglycerol，TAG)，占乳脂總量的95%～98%，其次是二酰甘油、磷脂、膽固醇以及小部分的游離脂肪酸(FFA)、共軛亞油酸、神經(jīng)鞘磷脂、丁酸和醚脂類物質(zhì)等活性物質(zhì)[9]。TAG是乳脂的主要成分，是由3個脂肪酸酯化到甘油-3-磷酸骨架上形成的。反芻家畜中用于合成脂肪酸的來源主要有兩種：一種是在乳腺上皮細胞中從頭合成；另一種是從血液中吸收而來(碳元素大于16的長鏈脂肪酸)。反芻動物乳腺中乳脂的合成有1/2是來自于奶牛每天的飼喂飲食，其余的乳脂主要是由乳腺細胞自身合成[10]：少于C16的中鏈或短鏈脂肪酸直接在乳腺上皮細胞上從頭合成；于C16 (包括C16 (軟脂酸))的長鏈脂肪酸從血液進入到乳腺上皮細胞中。

乳腺上皮細胞的從頭合成過程：反芻動物的瘤胃發(fā)酵的乙酸和β-羥丁酸(BHBA)作為底物[11]，在乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl-coenzyme A carboxylase alpha，ACACA)的催化下生成乙酰輔酶A(acetyl coenzyme，Acyl-CoA，乙酰-CoA)，進入乳腺上皮細胞后，BHBA轉(zhuǎn)化為丁酰CoA，隨后在脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)的作用下為碳鏈的延長提供碳原子(以2C單位延長碳鏈)，當脂酰鏈合成達到C16時，轉(zhuǎn)?；搁_始參與并終止碳鏈延長(脂酰鏈的合成)[12]。

血液的乳脂合成過程：首先，奶牛日糧中的脂肪被水解成非酯化脂肪酸，瘤胃微生物將這些日糧脂肪還原為飽和脂肪酸，該過程主要把硬脂酸(C18∶0)(一部分)酯化形成極低密度脂蛋白(very-low density lipoprotein，VLDL)；隨后，VLDL在十二指腸內(nèi)被吸收、釋放到血液中；最后，VLDL被乳腺中重新攝取后再次分解，VLDL去飽和后形成TAG[13]。

1.2 乳脂的分泌

乳脂的主要分泌形式是乳脂球，從頭合成途徑的脂酰輔酶A以及外源攝取的脂肪酸在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上通過酯化反應結(jié)合到甘油-3-磷酸骨架上形成TAG。在乳脂分泌的過程中，小脂滴的形成來源于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙分子層膜間形成TAG。在乳脂滴的分泌過程中，有些脂滴直接移到乳腺上皮細胞的頂端等離子體膜上，而部分脂滴是先形成大的脂滴后，再移動到等離子體膜上，最后細胞膜包裹乳脂滴釋放到細胞外。此外，脂滴也可以通過分泌小泡的形成胞質(zhì)液泡，在乳腺上皮細胞頂膜上通過胞吐作用釋放脂滴[14]。

2 乳脂合成與分泌過程中相關(guān)蛋白、酶的調(diào)控[6]

奶牛乳脂的合成與分泌過程中，不同種類與數(shù)量的脂肪酸使牛奶中含有了不同分子量和飽和度的甘油三酯，也就是乳脂。乳脂合成中前體物的運輸、TAG的合成與轉(zhuǎn)運、脂滴的合成與分泌等過程需要多個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)移蛋白、酶、調(diào)控因子的相互作用。

2.1 長鏈-CoA的生成(脂肪酸的從頭合成、LCFA被運輸?shù)饺橄偌毎麅?nèi))

2.1.1 ACSL1和FABP3協(xié)同促進長鏈CoA的生成 在ACACA和FASN的協(xié)同作用下，利用乙酰-CoA和丁酰輔酶a來促進脂肪酸的從頭合成。乙酰-CoA在由?；o酶a激酶2(ACSL2)所攜帶的醋酸鹽中形成。脂肪酸合成過程中，碳元素在10個以上時會被合成長鏈的?；o酶a激酶1(ACSL1)激活后再結(jié)合到脂肪酸結(jié)合蛋白3(fatty acid-binding protein 3，F(xiàn)ABP3)上，促使合成長鏈CoA。

2.1.2 胞外的LCFA在ACSL1和FABP3的作用下生成長鏈CoA 在極低密度脂蛋白受體(very-low density lipoprotein receptor，VLDLR)的協(xié)助下，細胞內(nèi)的脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)將VLDL和TAG水解后釋放出LCFA 到胞外；隨后，LCFA在蛋白-調(diào)節(jié)機制的引導作用下進入乳腺細胞內(nèi)。整個蛋白—調(diào)節(jié)機制中，CD36分子是調(diào)控LCFA運輸?shù)淖铌P(guān)鍵因子；當LCFA通過細胞膜進入乳腺細胞后，在ACSL1的激活作用下形成長鏈-CoA，長鏈-CoA在FABP3的捕捉作用下被運輸?shù)教囟ǖ募毎麅?nèi)。長鏈-CoA的激活，本質(zhì)上就是將LCFA困在乳腺細胞內(nèi)為TAG的合成做準備。

2.2 LCFA或長鏈-CoA被FABP3捕捉運輸

FABP3捕捉LCFA或長鏈-CoA后會將其作為硬酯酰CoA去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase)，SCD)的底物，在FABP4的轉(zhuǎn)運作用下參與TAG的合成。TAG合成過程中有3個關(guān)鍵轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)控：①在三酰基甘油固醇?；D(zhuǎn)移酶6(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6，AGPAT6)的作用下將長鏈-CoA轉(zhuǎn)移至溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)sn-2位置上并生成磷脂酸(phosphatidic acid，PA)；②在類脂1(lipin 1，LPIN1)的作用下將PA的磷酸基團酶解生成二酰甘油(diacylglycerol，DAG)；③在二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1(diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1)的作用下將長鏈-CoA轉(zhuǎn)移至DAG sn-3位置上生成TAG。因此，LCFA或長鏈-CoA可直接作為原料參與TAG的合成。

2.3 XDH、ADFP和BTNIAI參與脂滴的生成

在奶牛乳腺上皮細胞中，形成的TAG會在乳腺細胞的小葉內(nèi)形成脂滴并在脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation related protein，ADFP)(圓形的黃色)與嗜乳脂蛋白(BTNIAI)(半月形的棕色)在作用下參與脂滴的形成與分泌途徑。除此之外，在乳脂滴的分泌途中，黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XDH)也起到了協(xié)助導向的作用，但目前為止XDH的具體協(xié)同作用機制尚未可知[6]。

2.4 TAG合成過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用

過氧化物酶體増殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)在FABP3捕捉LCFA或長鏈-CoA的運輸過程中起到非常重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。參與脂肪酸轉(zhuǎn)運的基因包括LPL、CD36和ACSL1是PPARγ基因的靶向調(diào)控基因[6]。研究表明，PPARγ激活劑1α(PPAR gamma，coactivator 1 alpha，PPARγC1A)和LPIN1是PPARγ的輔助因子，在哺乳期間，基因PPARγC1A和LPIN1的表達上調(diào)促使PPARγ在調(diào)控脂質(zhì)代謝過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[15-16]。

參與脂肪酸從頭合成的基因受固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol-regulatory element binding protein 1，SREBP1)的調(diào)控，SREBP1屬于核轉(zhuǎn)錄因子家族，是調(diào)控膽固醇和脂肪酸從頭合成基因表達的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。大量研究表明，在小鼠[17]和奶牛[18]的乳脂合成中，SREBP1和SREBP2能夠通過激活ACACA、FASN、VLDLR、胰島素誘導因子1(insulin induced gene 1，INSIG1)等有關(guān)乳脂合成基因的表達來調(diào)控TAG的合成過程。

3 調(diào)控乳脂關(guān)鍵基因的研究進展

目前，通過對奶牛乳腺組織中各個基因的表達研究，已經(jīng)建立了涉及脂肪酸合成與運輸、脂滴形成、酮體利用以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因的表達，如表1所示[19]。

表1 奶牛乳脂合成過程中相關(guān)基因信息

3.1 LPL

脂肪被乳腺細胞吸收是乳脂產(chǎn)生的關(guān)鍵。脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)是血脂代謝的中心分子，其主要功能是以同源二聚體的形式作為TAG的水解酶以及作為配體介導脂蛋白攝入的雙重功能。當血液流經(jīng)乳房時，LPL將血液中的VLDL或乳糜微粒固定在乳腺內(nèi)皮細胞上，通過水解作用將脂蛋白所攜帶的TAG水解成甘油和脂肪酸，再被乳腺組織吸收利用，合成乳脂[28]。與其他組織相比，乳腺中的LPL基因具有更高的表達活性，研究證明，早在牛奶合成之前，LPL基因的表達量就已經(jīng)開始顯著上調(diào)[6]。在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺組織中LPL基因的表達水平從孕期到泌乳期增加了2倍之多[28]，并在泌乳期能持續(xù)保持高水平的表達量，而奶牛乳腺LPL基因的表達模式與泌乳曲線非常相似，這可能表明LPL基因在維持牛奶合成的過程中具有重要作用；同時，LPL還通過與VLDLR結(jié)合，增強乳腺細胞富集脂蛋白的能力[29]。因此，LPL是決定脂肪細胞的大小程度與脂肪蓄積的重要標志。

3.2 CD36

分化抗原簇36(CD36)也稱為清道夫受體B2、脂肪酸轉(zhuǎn)移酶(fatty acid translocase，F(xiàn)AT)，是介導LCFAs整個跨膜轉(zhuǎn)運與脂肪酸吸收利用的限速因子。研究證明，超過90%的胞外LCAFs是通過膜轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞的。

CD36/SR-B2(cluster of differentiation 36/scavengerreceptor B2)是促進脂肪酸轉(zhuǎn)運的主要膜蛋白之一[30-31]。CD36/SR-B2通過作為脂肪酸的受體，富集并結(jié)合相應的脂肪酸后定位在細胞外膜的脂筏結(jié)構(gòu)上；隨后脂肪酸的極性羧基從脂質(zhì)層的胞外轉(zhuǎn)進胞內(nèi)；最后脂肪酸被釋放于細胞內(nèi)膜進入細胞質(zhì)，并與FABP結(jié)合開始重吸收利用。研究表明，CD36/SR-B2能促進細胞對n-3長鏈多不飽和脂肪酸的攝取[32]，CD36/SR-B2具有與FABP或ACSL協(xié)同促進脂肪酸的攝取與轉(zhuǎn)運的影響作用。

3.3 FABPs

LCFA在細胞內(nèi)的自由擴散和選擇性靶向特定細胞器的過程都需要特定轉(zhuǎn)運體協(xié)助，而脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)是奶牛乳腺細胞內(nèi)主要的脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白。Massimo Bionaz等人通過qPCR技術(shù)分析了在分娩前15 d，分娩后15 d，60 d與240 d的荷斯坦奶牛各6頭，發(fā)現(xiàn)在奶牛乳腺組織中FABP3、FABP4、FABP5基因的表達量較高，而其余亞型幾乎檢測不到。在奶牛的乳腺發(fā)育與泌乳期中，F(xiàn)ABP3基因的表達量具有優(yōu)勢地位，在奶牛產(chǎn)后15 d時表達量顯著上升，是產(chǎn)前的40倍[33]。此外，F(xiàn)ABP3可以通過捕獲長鏈-CoA并轉(zhuǎn)運到特定的胞內(nèi)細胞器中來捆綁并激活胞內(nèi)LCFA，以供后期脂肪酸的合成利用[6]。

3.4 ACACA和FASN

在奶牛乳腺上皮細胞中ACACA和FASN是催化脂肪酸從頭合成過程的關(guān)鍵酶。ACACA是脂肪酸合成的限速酶，可以催化乙酰CoA生成丙二酸單酰輔CoA，而丙二酸單酰CoA作為LCFA碳鏈延長的C2供體并促進TAG與磷脂的合成[34]。研究表明，ACACA的表達受多種營養(yǎng)因素、激素及一些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，食物中脂肪的增加和碳水化合物的減少會引起ACACA濃度顯著下降，說明ACACA基因的表達量受高碳水化合物食物的影響；胰島素具有增強三碘甲狀腺氨酸促使ACACA基因轉(zhuǎn)錄的作用，而胰高血糖素可以抑制胰島素和三碘甲狀腺氨酸對ACACA基因表達的影響[35]。

FASN是一種結(jié)合縮合、還原、轉(zhuǎn)酰、脫水等7種活性于一體的大分子蛋白復合物。在反芻動物的脂肪酸合成中，F(xiàn)ASN能夠影響MCFA的生成和釋放。在泌乳期時，F(xiàn)ASN在輔酶NADPH的存在下具有催化乙酰CoA和丙二酸單酰輔酶A生成LCFA的作用(如C16)[36]，奶牛乳脂肪酸中大部分是LCFA，而乳脂肪酸的MCFA主要是通過奶牛瘤胃將飼草料的碳水化合物經(jīng)過酶解發(fā)酵后產(chǎn)生乙酸(acetate)和BHBA生成。

3.5 SCD

在反芻動物乳腺中，硬脂酰CoA去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)是可以直接影響脂肪酸的含量和組成、增加不飽和脂肪酸比例的關(guān)鍵酶。SCD通過在飽和脂肪酸(硬脂酸和棕櫚酸)的第9和10碳原子間導入氫鍵，使其分別形成單不飽和脂肪酸油酸和棕櫚油酸，是合成膜磷脂、脂肪酸的主要底物。SCD基因的表達及其產(chǎn)物的活性影響多種關(guān)鍵的生理學參數(shù)如肥胖癥、動脈粥樣硬化、糖尿病及高血壓等。張蕊等人在關(guān)于SCD基因的功能與調(diào)控的報道中指出[37]，在高能飼糧條件下飼喂的SCD基因缺陷型小鼠身上發(fā)現(xiàn)，其體脂沉積在大大減少，而SCD基因缺失的小鼠不能減輕高脂飲食所帶來的肥胖與脂肪肝癥狀。由于SCD的表達量或者酶活性可以改變細胞內(nèi)飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的比例，因此在畜牧生產(chǎn)中，人們通過對SCD的多態(tài)性分析進行選種選育。

3.6 CIDEC

在脂肪代謝中DNA斷裂因子相似蛋白C(cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-like effector，CIDEC)是調(diào)節(jié)TAG儲存和脂滴大小的關(guān)鍵蛋白。在奶牛研究中，CIDEC存在于泌乳的乳腺組織中，且過表達CIDEC基因會引起奶牛乳腺細胞中TAG的含量和脂滴數(shù)的顯著增加[38]，CIDEC基因具有正向調(diào)節(jié)乳脂合成的功能。在CIDEC的功能研究中發(fā)現(xiàn)，CIDEC家族因子是可結(jié)合在脂滴表面、促進大脂滴生成、脂肪儲存的肥胖因子[39]。已有實驗證明，在小鼠胚胎成纖維細胞，過表達CIDEC基因可使細胞中產(chǎn)生大量脂滴，而干擾CIDEC基因后的細胞不但抑制其分化功能、脂滴生成，還抑制乳脂分泌[40]。研究表明，CIDEC基因的表達受到2個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控——增強子結(jié)合蛋白C/EBP及PPARγ。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)C/EBP能結(jié)合在CIDEC基因的啟動子上并激活其表達，而PPARγ可以靶向CIDEC基因并激活其轉(zhuǎn)錄，從而在轉(zhuǎn)錄水平上激活與促進CIDEC的表達，調(diào)控乳脂的合成[41-42]。

3.7 SREBP1

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBP)在轉(zhuǎn)錄水平對脂肪酸和膽固醇的合成起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[43]。大量的研究表明，在泌乳期間，作為奶牛乳脂合成過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因——SREBF1能正向調(diào)控FASN基因的表達，具有促進奶牛乳脂合成的作用[44]。通過RNA干擾技術(shù)沉默奶牛乳腺上皮細胞SREBP1基因后發(fā)現(xiàn)，與脂肪酸從頭合成關(guān)鍵酶的含量均顯著下降并影響了脂肪酸的合成與轉(zhuǎn)錄[43]。SREBF1是乳脂合成調(diào)控的核心，在FASN、PPARγ、PPARγC1A和INSIG1基因的協(xié)同作用中起著舉足輕重的作用。

3.8 PPARs

乳腺組織中過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferater-activated receptors，PPARs)是調(diào)控脂肪合成與細胞增殖的關(guān)鍵受體，處于脂肪合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的中心位置。Mani等人研究證明，PPARs可以通過活化脂肪細胞中乙酰輔酶A(acetyl-CoA)和葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(glucose transporter 4，GLUT4)等基因表達，促進脂肪細胞中ATG的合成増加[44]。

妊娠期小鼠及泌乳牛的乳腺發(fā)育研究表明，PPARγ基因的表達明顯上調(diào)[6-7,44]。Graugnard證明了在反芻動物體內(nèi)，PPARγ是主要的脂肪合成調(diào)控因子，主要是通過與乳脂合成的關(guān)鍵基因，如：ACC、FASN、LPIN1、SREBP、INSIG1、SCD等靶向結(jié)合而影響LCFA的代謝[33]。劉莉莉等人[45]通過探究PPARγ對奶牛乳腺上皮細胞乳脂肪合成相關(guān)基因表達的影響研究發(fā)現(xiàn)：沉默或超表達PPARγ，不僅可以調(diào)控脂肪酸從頭合成酶基因(ACC、FAS)，脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白基因(CD36、FABP3、ACSL1)，還能影響DCMECs甘油三酯合成的關(guān)鍵酶的表達。其中，在非反芻動物的乳脂研究中，CD36和ACSL1已被驗證是PPARγ基因的已知靶基因[46]。PPARγ既能影響DCMECs轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因表達，還能調(diào)節(jié)乳脂肪合成過程中其它相關(guān)蛋白，PPARγ是奶牛乳脂肪合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，能直接或通過激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SREBP1而調(diào)控乳脂肪合成[47]。

4 結(jié) 語

通過激素(催乳素、孕激素等)協(xié)同作用所產(chǎn)生的激素—激素受體—信號網(wǎng)絡通路來調(diào)控乳腺發(fā)育以及乳脂的合成，營養(yǎng)素、生長因子、激素等信號會刺激與乳腺細胞增殖、乳脂合成及泌乳相關(guān)基因的表達。從血液中FA的主動攝取(如LPL、CD36基因)以及細胞內(nèi)與乳脂合成、運輸?shù)认嚓P(guān)基因的表達顯著上調(diào)(如FABP3基因)是奶牛泌乳的關(guān)鍵特征。奶牛的泌乳行為誘導了參與FA激活(如ACSL1基因)、從頭合成(如ACACA、FASN基因)、去飽和(如SCD基因)、脂滴形成(如BDH1、OXCT1基因)等過程中關(guān)鍵基因mRNA的表達上調(diào)。在奶牛產(chǎn)后60 d左右，參與乳腺脂質(zhì)合成過程中具有關(guān)鍵作用的調(diào)控基因表達達到高峰，并持續(xù)跟隨奶牛的泌乳曲線而呈現(xiàn)曲線表達模式[6]。本文從乳脂合成與分泌、關(guān)鍵調(diào)控蛋白與基因的層面系統(tǒng)的闡述了影響乳脂合成的因素，并歸納出最新的影響乳脂合成相關(guān)基因信息表，力圖通過在分子生物學領域內(nèi)為深入研究乳脂合成相關(guān)基因的表達與信號網(wǎng)絡的調(diào)控機制提供研究依據(jù)。