聚乳酸/納米Fe3O4載多柔比星緩釋劑的研究*

馬喜峰

（陜西國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安710300）

前 言

多柔比星即鹽酸多柔比星，又稱阿霉素（Adriamycin，ADM，doxorubicin），具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用，臨床上用于治療乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等各種癌癥[1]。多柔比星有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，在動(dòng)物中有致癌作用，在人體也有潛在的致突變和致癌作用。臨床上，伴隨多柔比星的大范圍使用，骨髓抑制、心臟毒性、消化道反應(yīng)、脫發(fā)、組織潰瘍和壞死、肝功能異常等不良反應(yīng)越來越多。

將多柔比星制成含有聚乳酸的磁性靶向藥物，利用外部磁場將其引導(dǎo)至靶部位，隨著聚乳酸的緩慢解離而不斷釋放藥物，可以提高藥物在靶向部位的濃度，加速治療效果[2～4]。這方面的研究成為全世界藥學(xué)界科學(xué)研究的焦點(diǎn)，國內(nèi)人們對新藥研發(fā)力度尚不夠，認(rèn)識(shí)不足，投入也較少，相關(guān)研究相對較少。如何制備出具有緩釋功能的多柔比星磁性靶向試劑具有重要的意義[5～6]。

本研究使用無毒且具有良好的生物相容性及可降解高分子材料聚乳酸（polylactide，PLA）和磁性納米四氧化三鐵（Fe3O4）顆粒為載體，制備了聚乳酸／納米四氧化三鐵載多柔比星的磁性靶向復(fù)合微球，產(chǎn)物具有緩釋和磁性靶向功能，可以有效地被輸送至病變部位，從而減少用藥劑量和給藥次數(shù)，提高藥物的治療指數(shù)，降低藥物的不良反應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

聚乳酸（PLA），醫(yī)藥級(jí)，上海瑞永生物科技公司；注射用鹽酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride injection），大連美侖生物技術(shù)有限公司；明膠，生化試劑，鄭州隆鑫生物科技有限公司；磷酸二氫鉀，分析純，上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；吐溫80（聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯，簡稱聚山梨酯-80），分析純，遼寧奧克醫(yī)藥輔料股份有限公司；磷酸氫二鈉，分析純，遼寧奧克醫(yī)藥輔料股份有限公司；納米四氧化三鐵，分析純，蘇州優(yōu)鋯納米材料有限公司；二氯甲烷，分析純，鄭州卓利化工產(chǎn)品有限公司。

SS-450臺(tái)式離心機(jī)，張家港市銳騰機(jī)械制造有限公司；UV-1800PC-OSZ分光光度計(jì)，上海科曉科學(xué)儀器有限公司；ZNCL-BS（180×180mm）智能磁力（加熱板）攪拌器，上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；JJ-1 A小型數(shù)顯電動(dòng)攪拌器，深圳市良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；KH-50B超聲波清洗機(jī)，歐萊德科學(xué)儀器（北京）有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海海向儀器設(shè)備廠；SHB-IIIA循環(huán)水式真空泵，臨海市永昊真空設(shè)備有限公司；2402蹄形磁鐵，余姚市華賜教學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 多柔比星最大吸收波長的確定和工作曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取適量的多柔比星，加入pH值為6的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配制成150μg·mL-1的多柔比星溶液；取該多柔比星溶液5mL，將其與等體積H2SO4溶液（濃H2SO4與水的體積比為3∶1配制而成）混合均勻，放入60℃水浴中加熱20min，取出混合液后冷卻至室溫。用分光光度計(jì)掃描200～400nm的吸收波長，繪制多柔比星對光的吸收曲線，確定最大吸收波長λmax[7～9]。

將多柔比星標(biāo)準(zhǔn)溶液按一定比例稀釋成不同濃度的溶液，以PBS為參比溶液，在最大吸收波長處測定稀釋后不同濃度多柔比星溶液的吸光度A，以多柔比星濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。

1.2.2 聚乳酸/納米四氧化三鐵載多柔比星微球的制備

采用“乳化-溶劑揮發(fā)法”[10～11]。在200mL燒杯中，加入1mL吐溫80和一定量的明膠溶液，高速攪拌均勻。稱取一定量的聚乳酸置于燒杯中，取適量二氯甲烷溶解聚乳酸，待聚乳酸溶解完成后，在其中加入一定量多柔比星和一定量納米四氧化三鐵，超聲波進(jìn)行分散。將超聲波分散液加入到高速攪拌的明膠溶液中，攪拌5min，在室溫下低速攪拌3h，使二氯甲烷揮發(fā)完全。再經(jīng)過離心分離、過濾、蒸餾水洗滌，真空干燥后得白色粉末狀固體即為聚乳酸/納米Fe3O4載多柔比星微球（簡稱多柔比星微球）[12～13]。

1.2.3 體外釋藥行為

用動(dòng)態(tài)模透析法[12～14，15]測定上述制備的多柔比星微球的體外釋藥性。準(zhǔn)確稱取100g多柔比星微球置于透析袋中，將透析袋放入150mLpH值為6的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，溫度控制在37±0.5℃，轉(zhuǎn)速控制在120r·min-1。每隔1～2h取出5mL袋外溶液，并及時(shí)補(bǔ)充相同體積的PBS緩沖溶液[16～17]。

按上述“1.2.1”的方法，分別測定取出液的吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)處濃度C并計(jì)算出累計(jì)釋藥量（總共釋放出的藥量：藥物其實(shí)總量）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累計(jì)釋藥量為縱坐標(biāo)繪圖曲線。

1.2.4 微球磁響應(yīng)的測定

用分光光度法測定最優(yōu)因素制備的聚乳酸/納米Fe3O4載多柔比星微球磁沉降曲線[18]。稱取30mg微球加入100mLpH值為6的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，超聲分散20min。平均分成2份，其中一份置于磁場中，隔一定時(shí)間取溶液1/2處測量其透光率（在最大吸收波長232.5nm）；另一份懸浮液靜置，自然沉降，隔一定時(shí)間取上層澄清液體測其透光率。

2 結(jié)果與討論

2.1 多柔比星的工作曲線

實(shí)驗(yàn)測得，多柔比星的最大吸收波長為λmax=232.5nm。在最大吸收波長處測定多柔比星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，繪制工作曲線并進(jìn)行線性回歸，擬合的線性方程為A=0.08433c-0.007589，R2=0.9982。實(shí)驗(yàn)表明，多柔比星在40～400μg·mL-1范圍內(nèi)吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化處方和工藝

以多柔比星微球的平均載藥量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以多柔比星用量（A）、PLA濃度（B）、乳化溫度（C）、吐溫80用量（D）四個(gè)顯著因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化制備工藝。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表1。

從上表可以看出，各因素對平均載藥量的影響主次依次為A＞C＞B＞D。A因素中，k3＞k2＞k1；B因素中，k2＞k3＞k1；C因素中，k1＞k2＞k3；D因素中，k3＞k2＞k1。因此，確定最佳工藝條件為A3B2C1D3，即多柔比星用量40mg、PLA濃度0.05mg·mL-1、乳化溫度20℃、吐溫80用量0.5g。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 The results and analysis of the orthogonal experiment

2.3 載藥微球的體外釋藥性

以時(shí)間為橫坐標(biāo)、藥物累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，作藥物緩釋曲線如圖1所示。

圖1 多柔比星微球體外釋藥百分?jǐn)?shù)與時(shí)間的關(guān)系曲線Fig.1 The relation curve of drug in vitro release percentage and time of the doxorubicin microspheres

從圖1可以看出，多柔比星微球在前2h左右，具有明顯的突釋現(xiàn)象，隨著時(shí)間的推移，釋藥速率趨于平緩且?guī)缀踅咏鼊蛩?。這主要是因?yàn)榍捌卺尫诺氖俏接谖⑶虮砻娴乃幬锓肿踊蛘咚幬锛?xì)小粒子，后期釋放的是分散在載體材料骨架或者包封在載體材料內(nèi)部的藥物，因此前期釋放速度快，后期釋放速度慢且均勻。聚乳酸/納米四氧化三鐵載多柔比星微球的釋藥時(shí)間長，說明納米四氧化三鐵的加入使聚乳酸對四氧化三鐵的包覆效果增加，可以使藥效溫和而持久。

2.4 微球磁響應(yīng)

圖2 多柔比星微球磁沉降曲線Fig.2 The magnetic deposition curve of doxorubicin microspheres

由圖2可看出，多柔比星磁性微球在經(jīng)磁分離10min后，透光率就達(dá)到了75%；而無外加磁場時(shí)，懸浮液的透光率變化緩慢，說明微球粒子只是在重力作用下沉降；當(dāng)外加磁場時(shí)，懸浮液的透光率迅速上升，微球的沉降速度大，說明微球在外加磁場的作用下，有強(qiáng)的磁響應(yīng)。

3結(jié)論

采用乳化-溶劑揮發(fā)法，以醫(yī)藥級(jí)可生物降解高分子材料聚乳酸為載體，在其中加入醫(yī)藥級(jí)多柔比星與納米Fe3O4制備出聚乳酸/納米Fe3O4載多柔比星緩釋微球。通過正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了制備工藝，并對緩釋劑的體外實(shí)驗(yàn)行為和磁性做了研究。結(jié)果表明，該緩釋微球具有明顯的藥物緩釋作用，F(xiàn)e3O4的加入使微球具有磁性，可以被有效地輸送至指定部位，本研究可為臨床多柔比星磁性緩釋劑的研究提供參考。