飼喂高蛋白日糧對雛鵝血清尿酸水平、肝臟和腎臟超微結(jié)構(gòu)及ABCG2表達(dá)的影響

王 志，胡仲皓，桂雪兒，馮士彬，李 玉，王希春，李錦春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

尿酸是禽類嘌呤代謝的最終產(chǎn)物[1]。機(jī)體中的尿酸水平取決于2個因素，一是尿酸在肝臟中合成的速度。尿酸是嘌呤的代謝產(chǎn)物，尿酸水平受控于機(jī)體產(chǎn)生或吸收的嘌呤量；二是尿酸自腎臟排泄的速度[2]。尿酸排泄對血尿酸水平的影響最大，禽類高尿酸血癥主要是由于尿酸排泄減少引起的[3]。尿酸生成和/或排泄異常，可導(dǎo)致血清尿酸水平增加，當(dāng)超過一定值時就形成高尿酸血癥[4]。研究證實(shí)，高尿酸血癥會導(dǎo)致痛風(fēng)、腎功能異常等疾病的發(fā)生發(fā)展，對機(jī)體健康造成極大的危害[5]。因此，加強(qiáng)高尿酸血癥的防治具有重要的理論和實(shí)際意義。

尿酸的排泄是一組表達(dá)在腎近曲小管上的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)分子協(xié)同運(yùn)作的結(jié)果[6]。尿酸排泄障礙的最常見原因是尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體在腎臟的表達(dá)異常。目前研究認(rèn)為，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ABCG2)負(fù)責(zé)尿酸的排泄，與高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)生密切相關(guān)。相比其他尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(URAT1和GLUT9)，ABCG2的基因變異種類最多，對血尿酸水平的影響最大[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過飼喂高蛋白造雛鵝高尿酸血癥模型，研究雛鵝高尿酸血癥對ABCG2表達(dá)的影響，為高尿酸血癥的治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及飼糧

實(shí)驗(yàn)選用體重(112±1.09) g左右的1日齡雁鵝72只，隨機(jī)分成對照組(CP)、高蛋白1組(HP1)，高蛋白2組(HP2)，每組24只鵝?；A(chǔ)飼糧參照鵝的營養(yǎng)需要制備，其中粗蛋白質(zhì)含量為18%。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，HP1組粗蛋白質(zhì)含量為23%的飼糧，HP2組粗蛋白質(zhì)含量為28%的飼糧，3種飼糧的能量水平一致。3種飼糧組成見表1。試驗(yàn)為期14 d。雛鵝自由采食，充足飲水，按正常免疫程序進(jìn)行免疫接種。

1.2 樣品采集

每組隨機(jī)選取10只7日齡和14日齡鵝，空腹8 h 后頸靜脈采血1～2 mL，室溫傾斜靜置30 min，3 000 r·min-1離心15 min后分離血清，-20 ℃保存。采取14日齡鵝的肝臟、腎臟、十二指腸、空腸，一部分存于凍存管中，一部分固定于體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液中，另一部分固定到體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛中，用于日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡觀察并拍照。

1.3 血液尿酸測定

7日齡和14日齡鵝的血液尿酸濃度用邁瑞B(yǎng)S-220全自動生化分析儀測定。

1.4 主要儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所涉及的主要儀器和試劑：全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司BS-220，中國)，上海源葉生物科技有限公司ELISA檢測試劑盒，ABCG2抗體(Affinity，中國)，RIPA細(xì)胞裂解液(Biosharp，中國)，蛋白磷酸酶抑制劑(Solarbio，中國)，BCA蛋白質(zhì)濃度分析試劑盒(Biosharp，中國)，β-Actin Mouse Monoclonal Antibody(Beyotime，中國)，彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Beyotime，中國)，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠Ig G(中山金橋，中國)，電泳儀(EPS300，Tanon，中國)，Rrefrigerated Centrifuge(TGL-18R，Hema，中國)，ChemiDoc成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)，顯微鏡(Olympus CX31，日本)，透射電鏡(JEM-1230，日本)，Multiskan Mk3微孔板(Thermo Scientific，USA)，RNA濃度分析儀(NanoVue plus，Thermo，USA)，實(shí)時定量PCR儀器(Thermo，USA)。

表1 鵝的飼糧營養(yǎng)組成與含量(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 實(shí)時熒光定量PCR

將液氮研磨好的肝、腎、十二指腸、空腸組織放入1 mL Trizol試劑中，加入200 μL氯仿?lián)u勻20次，1 2000×g離心15 min，取500 μL上清液，加入500 μL異丙醇，1 2000×g離心10 min；棄去上清液，加入500 μL 80%乙醇，7 500×g離心5 min，棄去上清液。每個樣本取500 ng總RNA進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄。

GoTaqqPCR Master Mix System(Promega)用于測量mRNA表達(dá)。每個反應(yīng)包含互補(bǔ)DNA模板，10 μmol·L-1正向引物(2 μL)，10 μmol·L-1反向引物(2 μL)，2×GoTaqqPCR主混合物(25 μL)和ddH2O(可變)至總體積50 μL。使用以下熱循環(huán)程序進(jìn)行定量PCR(qPCR)：95 ℃持續(xù)2 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)的95 ℃持續(xù)15 s和60 ℃持續(xù)1 min。在qPCR后，通過在60 ℃下孵育反應(yīng)30 s，然后以0.2 ℃·s-1的速率將溫度從60 ℃升高至95 ℃來進(jìn)行熔解曲線分析。隨后，將反應(yīng)在20 ℃下溫育10 s，在42 ℃下溫育15 min，并在85 ℃下溫育5 s。使用2-ΔΔCt方法分析相對基因表達(dá)水平。用于鵝ABCG2表達(dá)的qPCR分析的引物序列如下：ABCG2-F：5′-TAGTGTTGGTCAGAGACAGC-3′；ABCG2-R：5′-GTGCAATGGTCAGAACTGTG-3′，長度為167 bp。

1.5.2 蛋白質(zhì)印跡

用RIPA細(xì)胞裂解緩沖液和蛋白磷酸酶抑制劑從肝、腎、十二指腸、空腸中提取總蛋白(300 mg，每組3只)，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，用電泳儀對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳。使用以下抗體：抗ABCG2，抗β-肌動蛋白，山羊抗兔IgG。免疫復(fù)合物用Western blotting檢測試劑盒(Advansta，USA)顯示，印跡用ChemiDoc-MP成像系統(tǒng)。用Imageproplus6.0分析譜帶密度，并與β-肌動蛋白譜帶密度進(jìn)行歸一化。蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平與正常對照組的平均水平一致。

1.5.3 免疫組化法學(xué)

將肝、腎、空腸和十二指腸組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片。ABCG2蛋白表達(dá)用抗ABCG2(1∶300)抗體進(jìn)行免疫組化檢測，以山羊抗兔IgG(1∶500)為二抗。免疫標(biāo)記切片在光學(xué)顯微鏡下觀察和成像(CX31，日本奧林巴斯)，免疫染色陽性面積和積分光密度(IOD)用Imageproplus6.0進(jìn)行測量，從每只雞的3個切片中隨機(jī)抽取9張圖像進(jìn)行IOD分析。為了定量分析免疫組化結(jié)果，平均光密度計(jì)算為：IOD/總區(qū)域。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan多重比較，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用GraphPad Prism 8做柱狀圖進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)鵝肝臟、腎臟組織電鏡觀察結(jié)果

2.1.1 試驗(yàn)鵝肝臟組織電鏡觀察結(jié)果

利用透射電鏡觀察試驗(yàn)鵝肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖1所示。CP組肝臟細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好，HP1、HP2組部分線粒體開始出現(xiàn)腫脹、空泡變性，糖原減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹消失。

2.1.2 試驗(yàn)鵝腎臟組織電鏡觀察結(jié)果

利用透射電鏡觀察試驗(yàn)鵝腎臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖2所示。CP組腎臟細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好，HP1、HP2組部分線粒體開始出現(xiàn)腫脹、空泡變性，核膜間隙增大。

2.2 7日齡和14日齡雛鵝尿酸水平

如表2所示，雛鵝7日齡時，HP2組鵝的血清尿酸水平極顯著高于CP組和HP1組(P<0.01)。雛鵝14日齡時，HP2組鵝的血清尿酸水平極顯著高于CP組和HP1組(P<0.01)，HP1組鵝血清尿酸水平極顯著高于CP組(P<0.01)。

2.3 鵝ABCG2在肝臟、腎臟、十二指腸、空腸中的相對表達(dá)量

qPCR結(jié)果如圖3所示，HP2組鵝十二指腸中ABCG2的相對表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于CP組和HP1組，空腸中ABCG2的相對表達(dá)量極顯著(P<0.01)高于CP組和HP1組，腎臟中ABCG2的相對表達(dá)量極顯著低于CP組和HP1組(P<0.01)。HP1組鵝腎臟ABCG2的相對表達(dá)量顯著低于CP組(P<0.05)，空腸ABCG2的相對表達(dá)量顯著高于CP組(P<0.05)。各處理組的ABCG2相對表達(dá)量在肝臟中無明顯差異(P>0.05)。

放大倍數(shù)20 000×。A，CP組；B，HP1組；C，HP2組。下同。The magnification was 20 000 times the original size. A，Group CP; B，Group HP1; C，Group HP2. The same as below.圖1 各組鵝肝臟細(xì)胞電鏡圖片F(xiàn)ig.1 Transmission electron microscopic pictures of liver cells of goslings in each group

圖2 各組鵝腎臟細(xì)胞電鏡圖片F(xiàn)ig.2 Transmission electron microscopic pictures of kidney cells of goslings in each group

表2 7日齡和14日齡雛鵝血清尿酸值

2.4 鵝肝臟、腎臟、十二指腸、空腸中ABCG2蛋白表達(dá)水平

蛋白質(zhì)印記(Western-blotting)結(jié)果如圖4所示，HP2組鵝十二指腸、空腸ABCG2的相對表達(dá)量顯著(P<0.05)高于HP1組，極顯著高于CP組(P<0.01)，鵝腎臟ABCG2的相對表達(dá)量極顯著低于CP組和HP1組(P<0.05或P<0.01)；HP1組鵝空腸、十二指腸ABCG2蛋白的相對表達(dá)量顯著高于CP組(P<0.05)。HP1組鵝腎臟ABCG2蛋白的相對表達(dá)量顯著低于CP組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對照組的ABCG2表達(dá)強(qiáng)度在肝臟中無明顯差異(P>0.05)。

同一組織不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。The bars without the same lowercase or uppercase letters within the same organ showed significant difference at the level of 0.05 or 0.01，respectively. The same as below.圖3 鵝肝臟、腎臟、十二指腸、空腸中ABCG2-mRNA相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of ABCG2-mRNA in liver，kidney，duodenum and jejunum of goslings

圖4 鵝肝臟、腎臟、十二指腸、空腸中ABCG2蛋白表達(dá)量Fig.4 ABCG2 expression in liver，kidney，duodenum and jejunum of goslings

2.5 鵝肝臟、腎臟、十二指腸、空腸中ABCG2蛋白水平

免疫組化結(jié)果如圖5顯示，ABCG2蛋白在肝細(xì)胞、腎頂膜、腸平滑肌和腸絨毛中均有分布。HP2組鵝十二指腸中ABCG2的表達(dá)水平極顯著(P<0.01)高于CP組和HP1組，空腸中ABCG2的表達(dá)水平極顯著(P<0.01)高于CP組，顯著(P<0.05)HP1組，腎臟中ABCG2的表達(dá)水平和HP1組，極顯著低于CP組(P<0.01)。HP1組鵝十二指腸中ABCG2的表達(dá)水平極顯著(P<0.01)高于CP組，空腸中ABCG2的表達(dá)水平顯著(P<0.05)高于CP組，而腎臟ABCG2的表達(dá)水平顯著低于CP組(P<0.05)。CP、HP1和HP2組的ABCG2表達(dá)強(qiáng)度在肝臟中無明顯差異(P>0.05)。

圖5 鵝肝臟、腎臟、十二指腸、空腸中ABCG2蛋白表達(dá)量Fig.5 ABCG2 protein expression in liver，kidney，duodenum and jejunum of goslings

3 討論

肝臟和腎臟的超微結(jié)構(gòu)變化分析，高蛋白日糧可引起雛鵝肝臟和腎臟細(xì)胞器損傷，尤其是對腎臟的損傷[8-9]。腎臟是尿酸的主要排泄器官，腎臟損傷使尿酸排泄量降低，這也可能是高蛋白日糧誘發(fā)高尿酸血癥的主要原因之一。

已有文獻(xiàn)證實(shí)，飼喂高蛋白飼料會導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生[10-12]。尿酸在肝臟中合成，通過腎臟迅速排出體外，使血液中的尿酸濃度維持恒定[13]，但是當(dāng)機(jī)體生成尿酸過多，超過腎臟的排泄能力，將不可避免地發(fā)生高尿酸血癥[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，飼喂雛鵝高蛋白日糧導(dǎo)致雛鵝尿酸排泄增加，血液尿酸水平升高。本實(shí)驗(yàn)飼喂高蛋白日糧成功構(gòu)建了雛鵝高尿酸血癥模型。

ABCG2是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族G成員2[15]。ABCG2作為一種高容量的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可介導(dǎo)體內(nèi)尿酸排泄，當(dāng)其發(fā)生基因突變時可影響高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展[16]，其功能異?？蓪?dǎo)致尿酸排泄能力下降[17]。研究表明，ABCG2對于尿酸排泄具有重要作用，在研究高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要[18-20]。體內(nèi)尿酸主要通過腎臟排出體外，其次是通過腸道排出，從膽管排出的尿酸占所有排泄物的5%[21]。本研究結(jié)果表明，ABCG2在雛鵝肝臟、腎臟、空腸和十二指腸等器官均有表達(dá)，提示尿酸的腎腸排泄和膽汁排泄。飼喂高蛋白日糧誘導(dǎo)的高尿酸血癥雛鵝肝臟ABCG2表達(dá)水平無明顯變化，空腸和十二指腸中ABCG2表達(dá)水平上調(diào)，而腎臟中ABCG2表達(dá)水平下調(diào)，提示尿酸腎排泄減少而腸排泄增加。有報(bào)道稱rs223114和rs72552713介導(dǎo)的ABCG2突變可影響腸道尿酸排泄[22-24]，腸ABCG2在腎功能異常所致的腎尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降時可起到補(bǔ)償作用[25]。據(jù)此推測，持續(xù)飼喂高蛋白日糧引起ABCG2的過度表達(dá)可能是由于腎功能異常導(dǎo)致尿酸腎排泄減少腸排泄增加的一種代償機(jī)制。然而，這一機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，飼喂高蛋白日糧導(dǎo)致雛鵝肝臟、腎臟細(xì)胞受損，體內(nèi)尿酸水平升高，引發(fā)雛鵝高尿酸血癥，空腸、十二指腸ABCG2的表達(dá)增加，而腎臟ABCG2的表達(dá)降低。