精準定時輸精對后備母豬早期胚胎發(fā)育與繁殖性能的影響

朱志偉，陳曉宇，于福先，張 樑，黃 菁，王志剛，賴建兵，沈順新，殷文彬，潘建治，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 病毒學與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021； 2.寧波曠代畜牧科技有限公司，浙江 寧波 315181； 3.浙江欣宏源生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，浙江 青田 313900； 4.安吉正新牧業(yè)有限公司，浙江 安吉 313300)

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，生豬養(yǎng)殖已步入規(guī)?；?、集約化、技術(shù)化時代。后備母豬是豬場基礎(chǔ)繁殖群的重要種用來源，以往傳統(tǒng)后備母豬補充導入生產(chǎn)費時、費力、周期長、效率低，常常由于后備母豬發(fā)情遲緩、情期散亂不準、靜立反應(yīng)差而導致約30%的后備種群無法種用而作淘汰處理，影響豬場經(jīng)濟效益[1]。精準定時輸精(fixed timed artificial insemination，F(xiàn)TAI)是通過使用激素人為調(diào)控母豬性周期，使之在預定的時間集中發(fā)情、排卵和配種的一項繁殖新技術(shù)[2-3]，F(xiàn)TAI技術(shù)不必對后備母豬進行發(fā)情鑒定，只需按FTAI程序在預定時間對后備母豬進行激素處理和配種，可大幅提高后備母豬配種利用率，縮短非生產(chǎn)天數(shù)，提高生產(chǎn)與管理效率。20世紀90年代德國與東歐一些國家86%的豬場利用FTAI技術(shù)實現(xiàn)了豬場的批次化生產(chǎn)管理[1]；而我國養(yǎng)豬業(yè)由于集約化、規(guī)?；潭炔桓撸斯な诰夹g(shù)的普及效率不高，繁殖母豬科學管理程度不高等因素，對這項技術(shù)的研究與應(yīng)用尚屬于起步探索階段。本研究主要是探討定時輸精技術(shù)對后備母豬早期胚胎發(fā)育和主要繁殖性能的影響，為定時輸精技術(shù)在我國養(yǎng)豬業(yè)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以自主研發(fā)的生長速度快、肉質(zhì)優(yōu)的金烏黑豬(暫命名，源于杜洛克與金華地方豬)為材料，選取日齡220～240 d、體重110～120 kg的金烏黑豬43頭、大長二元后備母豬189頭，按試驗方案要求隨機分群。試驗豬要求體況健康，無生殖疾病，飼養(yǎng)管理均按所在養(yǎng)殖場正常飼養(yǎng)方式執(zhí)行。

試驗處理所需烯丙孕素、孕馬血清促性腺激素(PMSG)、促性腺激素釋放激素(GnRH)均購買自寧波三生生物科技有限公司(批號：20180302)。

1.2 精準定時輸精程序

參照寧波三生公司推薦的程序，試驗開始投藥前用果汁調(diào)教適應(yīng)2 d，正式投藥為每天15：00后，在喂料之前投藥槍飼喂烯丙孕素20 mg·頭-1，連續(xù)飼喂18 d，第19天停藥1 d。第20天09：00給每頭后備母豬肌肉注射PMSG 1 000 IU，第23天17：00每頭后備母豬肌肉注射GnRH 100 μg，第24天17：00對所有后備母豬進行第1次配種，第25天09：00對所有后備母豬進行第2次配種，第26天上午對仍表現(xiàn)靜立反應(yīng)的母豬補配1次。

1.3 試驗設(shè)計

試驗1：金烏后備豬隨機分群，實驗開始后，對照組豬不做任何處理，每天進行發(fā)情鑒定，按照常規(guī)人工授精配種；定時輸精試驗組后備豬分別于0 h(停喂烯丙孕素)、42 h(肌注PMSG)、122 h(肌注GnRH)靜脈采血5～10 mL，離心分離血清，檢測促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)和孕酮(P4)等生殖激素指標。試驗組和對照組分別隨機選擇4頭豬，在第2次配種結(jié)束后33 h屠宰雙側(cè)輸卵管，沖洗回收早期受精卵，回收到的受精卵分別在PZM-5發(fā)育液進行體外培養(yǎng)5～7 d，培養(yǎng)條件：37.5 ℃，5% CO2，5% O2，95% N2，飽和濕度。

試驗2：受試豬為大長后備母豬，試驗開始后，對照組后備豬不做任何處理，每天進行發(fā)情鑒定，按照常規(guī)人工授精配種；試驗組按精準定時輸精程序操作。為觀測精準定時輸精程序?qū)髠淠肛i的斷奶仔豬存活情況的影響，試驗時間延長到仔豬斷奶結(jié)束。

1.4 妊娠診斷

配種后第28～30天對試驗?zāi)肛i進行B超診斷，檢查是否受孕。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與數(shù)據(jù)分析

試驗豬血清激素檢測委托杭州金域醫(yī)學檢驗所檢測，試驗過程中詳細記錄參繁母豬、發(fā)情母豬、入配母豬、妊娠數(shù)、分娩數(shù)、窩總仔、窩活仔、斷奶數(shù)，計算配種率、妊娠率和參繁分娩率。實驗數(shù)據(jù)先使用Excel 2010進行初步整理，后使用SPSS 22.0進行單因素方差分析，采用Duncan’s進行多重比較和差異顯著性分析，結(jié)果使用平均值±標準差表示。

發(fā)情率(%)=發(fā)情母豬頭數(shù)/參繁母豬頭數(shù)×100；

配種率(%)=配種母豬頭數(shù)/參繁母豬頭數(shù)×100；

妊娠率(%)=情期妊娠頭數(shù)/參繁母豬頭數(shù)×100；

分娩率(%)=分娩母豬頭數(shù)/參繁母豬頭數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 定時輸精對后備母豬發(fā)情生殖激素的影響

精準定時輸精試驗組的母豬于處理0、42、122 h采集的血樣中4種激素測定結(jié)果如圖1所示。P4值在0 h至42 h由3.71 nmol·L-1下降至2.71 nmol·L-1，但差異不顯著(P>0.05)，在122 h時P4值下降至2.5 nmol·L-1(P>0.05)，表明停喂烯丙孕素后PMSG處理未對精準定時輸精試驗組母豬血液中的P4水平造成顯著影響(圖1-A)。E2值則在0 h至42 h由80 pmol·L-1顯著(P<0.05)下降至58.3 pmol·L-1；42 h至122 h，E2值極顯著(P<0.01)上升至134.07 pmol·L-1(圖1-B)。FSH值在0 h至42 h由0.05 IU·L-1略增至0.07 IU·L-1(P>0.05)，在PMSG作用下上升到0.09 IU·L-1(P>0.05)，但與42 h時血液中FSH含量相比仍無顯著性變化(圖1-C)。LH值在0 h至42 h由0.09 IU·L-1上升至0.12 IU·L-1(P>0.05)，在PMSG作用下，LH值在122 h又降至0.09 IU·L-1(P>0.05)，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但統(tǒng)計學上未見顯著差異(圖1-D)。

所有數(shù)據(jù)來自于14次獨立重復試驗結(jié)果，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。The data wa based on fourteen independent experiments，the different letter indicated significant difference (P<0.05)，and the same letters meant no significant difference (P>0.05).圖1 停喂烯丙孕素后不同時間檢測血液中各激素含量Fig.1 Levels of different hormones at different time points after cessation of allergenin

2.2 精準定時輸精程序?qū)髠淠肛i早期胚胎發(fā)育的影響

從表1可以看出，試驗組和對照組后備金烏母豬頭均排卵分別為17.5枚和15.25枚，差異不顯著(P>0.05)；屠宰輸卵管回收到的受精卵中單細胞、2-4-8細胞胚所占比率也未見顯著差異(P>0.05)；體外培養(yǎng)發(fā)育的囊胚率差異也不顯著(P>0.05)。胚胎形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯差異(圖2)。這說明定時輸精程序?qū)髠淠肛i排卵數(shù)和早期胚胎發(fā)育無不良影響。

2.3 精準定時輸精對試驗金烏豬繁殖性能的影響

由表2可知，后備金烏母豬定時輸精組與對照組的參與配種率分別為100%、90%，參繁分娩率分別為86.66%、85.00%，均無顯著差異(P>0.05)。窩均總產(chǎn)仔數(shù)分別為10.69頭、9.64頭，窩均活仔數(shù)分別為10.46頭、9.41頭，組間差異不顯著(P>0.05)；但與自然發(fā)情組相比，精準定時輸精組母豬窩均總產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)均提高約1.05頭，這說明經(jīng)FTAI程序處理不僅能提高后備母豬利用率，而且能提升窩均總產(chǎn)仔數(shù)與窩均活仔數(shù)。

2.4 精準定時輸精對大長后備母豬主要繁殖性能的影響

表3顯示，參繁大長后備母豬定時輸精組的參配率和分娩率分別為100%與93.61%，比對照自然發(fā)情組后備豬的參配率(93.68%)、分娩率(89.47%)高，組間差異不顯著(P>0.05)；定時輸精組后備豬窩均活仔數(shù)11.1頭，比對照組增加了0.58頭，組間差異也不顯著(P>0.05)；另外，定時輸精組的斷奶仔豬成活率高達91.91%，比對照組斷奶成活率88.92%提高了2.99百分點，組間差異不顯著(P>0.05)。說明精準定時輸精不僅可提高后備母豬的利用率、增加窩均活仔數(shù)，也有利于提高仔豬斷奶成活率。

表1 精準定時輸精程序處理對后備母豬早期胚胎發(fā)育的影響

A、B、C：試驗組胚胎，從左到右依次為2細胞期、4細胞期、囊胚期；D、E、F：對照組胚胎，從左到右依次為：2細胞期、4細胞期、囊胚期。標尺=100 μm。A，B，C: The embryo of FTAI group: 2 cell stage，4 cell stage and blastula stage; D，E，F(xiàn): The embryo of control group: 2 cell stage，4 cell stage and blastula stage. Bar=100 μm.圖2 胚胎早期發(fā)育情況Fig.2 Early embryonic development

表2 精準定時輸精程序處理對金烏豬繁殖性能的影響

表3 精準定時輸精程序?qū)Υ箝L母豬繁殖性能的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 定時輸精程序處理對后備母豬生殖激素的影響

母豬的正常發(fā)情周期啟動是在促性腺激素釋放激素、促卵泡素、促黃體素、雌激素、孕酮和催乳素(prolactin，PRL)等激素的共同調(diào)節(jié)作用下完成[4]。正常母豬的發(fā)情周期有黃體期和卵泡期。后備母豬定時輸精是模擬正常發(fā)情周期各相關(guān)激素水平的互作機制，利用特定的外源激素人為干預達到在預設(shè)時間段內(nèi)集中發(fā)情、排卵與配種。其中，飼喂外源激素烯丙孕素可維持生理周期的黃體期，維持體內(nèi)相對高位的孕酮水平，抑制腺垂體FSH的快速分泌，避免卵泡的增長排卵；一旦體內(nèi)孕酮水平下降就會刺激雌激素水平增加，促進腺垂體FSH與LH的分泌增加，促進卵泡的增大與發(fā)育，在這個過程中給予外源激素PMSG則有兼具FSH與LH的綜合作用，能短期內(nèi)輔助加速卵泡的發(fā)育；而一旦體內(nèi)FSH水平達到一定峰值，則需要通過使用具有LH活性的促性腺激素如hcG或通過使用GnRH類似物來誘導排卵。本研究采用的是ALT+PMSG+GnRH式FTAI，血樣采集時間為ALT停喂0、42、122 h，結(jié)果顯示，從定時輸精操作程序中外源藥物的停喂(0 h)至肌注PMSG(42 h)，血漿P4值呈逐漸降低趨勢；血漿E2值從80.0 pmol·L-1降至58.3 pmol·L-1，這主要是烯丙孕素的停喂解除了對腺垂體分泌FSH與LH的抑制，促進卵巢卵泡生長；在肌注PMSG(42 h)至肌注GnRH(122 h)，血漿E2值又上升至134.07 pmol·L-1，變化趨勢與Guthrie等[5]的研究結(jié)果相一致。0～122 h，血漿FSH值呈上升趨勢，而血漿LH值呈先上升后下降趨勢，與Guthrie等[6]的研究結(jié)果類似。Guthrie等[6]認為，卵泡成熟過程中，隨著E2增加，F(xiàn)SH存在減少的可能性，作者還證實卵泡排卵前黃體生成素含量升高發(fā)生的時間在停喂烯丙孕素后的5～6 d(122 h左右)。本試驗結(jié)果證明，F(xiàn)TAI程序中外源激素的給予時間點能模擬豬正常生理周期激素變化，起到協(xié)同發(fā)情排卵的作用。

3.2 定時輸精程序處理對后備母豬早期胚胎發(fā)育的影響

本試驗結(jié)果顯示，定時輸精試驗組豬卵巢排卵數(shù)比對照組增加，但差異不顯著，囊胚發(fā)育率與自然發(fā)情豬無顯著差異，說明定時輸精程序不影響受精胚胎質(zhì)量，這一結(jié)論與Degenstein等[7]的研究結(jié)果一致，其試驗中采用烯丙孕素飼喂17 d+PMSG+hcG方式，hcG處理后50～55 h屠宰，測定的排卵后形成的紅體有顯著差異，卵巢殘留的白體無顯著差異，并且其研究表明胚胎數(shù)的增加與后備母豬窩均總產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)的提高有直接關(guān)系。胚胎數(shù)的增加是因為定時輸精程序中PMSG具有FSH和LH的聯(lián)合作用，與自然發(fā)情內(nèi)源性激素的規(guī)律性相比，能增加排出的卵泡數(shù)。Ravagnani等[8]研究表明，在18 d內(nèi)使用ALT進行母豬發(fā)情同步，排卵率、胚胎數(shù)量、受精卵無顯著差異，但增加了妊娠第28天的腺管面積、周長和子宮內(nèi)膜總面積，因此為胚胎著床與妊娠提供了良好環(huán)境，也為最終母豬的窩均總產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)的提高奠定了生理基礎(chǔ)。

3.3 定時輸精程序處理對后備母豬繁殖性能的影響

FTAI程序處理的后備母豬100%可以參繁生產(chǎn)，有效降低了后備母豬的淘汰率，而且操作簡單、執(zhí)行力強、效率高。本研究采用的是ALT+PMSG+GnRH式FTAI，2個不同品種后備豬試驗結(jié)果均表明，參繁配種率、分娩率、窩均總產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)均比對照組要高，這與Wang等[9]和Lopes等[10]的結(jié)果一致。這主要與FTAI程序中飼喂烯丙孕素一定時間后卵巢狀態(tài)改善有一定關(guān)系，在協(xié)同使用PMSG下可獲得更多的卵泡發(fā)育與同步排卵，從而提高受精率和窩產(chǎn)仔數(shù)。吳寶云等[11]比較了精準定時程序ALT+PMSG+GnRH與簡式烯丙孕素式效果，結(jié)果表明，ALT+PMSG+GnRH式FTAI程序的窩均總產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)比簡式烯丙孕素式高。另外，本試驗結(jié)果顯示，后備母豬采用FTAI程序除了增加窩均總產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)外，斷奶成活率與自然發(fā)情豬相比提高了2.99百分點，這可能與FTAI生產(chǎn)的后代往往是批次式單元全進全出有一定關(guān)系，是否存在普遍性有待進一步研究。

綜上，本研究中ALT+PMSG+GnRH式精準定時輸精程序激素用藥處理符合母豬生理發(fā)情周期特質(zhì)，可增加排卵數(shù)，不影響早期胚胎發(fā)育，可提高后備母豬的利用率，增加窩均總產(chǎn)仔數(shù)、窩均活仔數(shù)，而且能提高仔豬斷奶成活率，可由此實現(xiàn)規(guī)模豬場的生產(chǎn)批次化。