蜂糖李花粉離體萌發(fā)及活力保存研究

高 倩，黃 榜，張安平，李 悅，陳 紅

(貴州大學 a貴州省果樹工程技術研究中心，b科技學院，貴州 貴陽 550025)

蜂糖李為李樹新良種，果實品質優(yōu)良，受到眾多消費者青睞，市場經(jīng)濟價值極高，現(xiàn)已發(fā)展成為具有貴州地域特色的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，近年來在我國其他一些省份也具有了一定知名度。但關于蜂糖李的研究還處于初級階段，許多生產(chǎn)上的難題還未解決，其中以坐果率低的問題最為突出。蜂糖李自花結實率低，花粉活力是否是造成坐果率低的原因，目前尚不明晰。生產(chǎn)上通過配置授粉樹、人工輔助授粉和花期化控等措施[1-2]，使坐果率有一定程度的提高。蜂糖李還可作為雜交育種的優(yōu)良種質資源，而較高的花粉活力是開展育種工作的基礎，因為花粉活力直接關系到授粉受精過程?；ǚ刍盍Τc自身質量有關外，也會受到外界條件的影響[3]。因此可通過人為篩選有利于花粉萌發(fā)和花粉管生長的環(huán)境條件，研究其影響機理，對提高授粉受精成功率具有重要意義，也可以為生產(chǎn)上的花期化控和雜交育種[4]提供理論參考。但李品種間的花期常常不一致，并且在自然狀態(tài)下花粉壽命通常較短，這增加了雜交授粉的難度。開展花粉貯藏性研究，可克服花期不遇的問題，能為李的跨時間和跨地域雜交授粉提供有利條件。

目前，有關李花粉活力的研究很多[5-7]，但多集中在花粉活力測定、礦質營養(yǎng)和植物生長調節(jié)劑對花粉萌發(fā)率的影響及花粉貯藏期間溫度對花粉活力的影響等方面。而將花粉管長度作為花粉活力評價指標，對影響花粉管長度因素的研究以及花粉貯藏過程濕度影響的研究較少，關于蜂糖李花粉活力的研究尚未見系統(tǒng)性的研究報道?；诖?，本研究分析了蔗糖、H3BO3和植物生長調節(jié)劑(NAA、GA3和6-BA)對蜂糖李花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響，并探討了貯藏方式對花粉活力的影響，篩選花粉離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基組分和最適宜貯藏方式，以期為蜂糖李的雜交育種和花期化控研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料蜂糖李以及坐果率高的對照品種青脆李，均取自貴州省黔南州惠水縣斷杉鎮(zhèn)大坡村蜂糖李栽培果園基地，基地面積200 hm2，海拔1 080 m，果園土壤為沙性土壤，pH 5.5～6.5；株行距3 m×4 m，樹齡5年。2019年2月22日，在蜂糖李和青脆李進入大蕾期時，分別采集樹冠外圍中部東南西北各方位的一年生枝條帶回實驗室備用。

1.2 花粉采集和貯藏試驗

摘取大蕾期的花朵，剝離出花藥，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內散粉。待花粉散出后用孔徑100 μm(150目)的標準檢驗篩過篩，分裝在指形管內。在管內放置變色硅膠，將花粉分別置于4 ℃低溫和-20 ℃冷凍條件下干燥貯藏。將蔗糖磨細后用孔徑125 μm(120目)的標準檢驗篩過篩，與花粉按體積比5∶1的比例混勻，裝至指形管2/3處，剩余1/3用過篩后的蔗糖填滿作為蔗糖密封保存處理。于貯藏0，5，10，15，20 d取樣，分析3種貯藏方式對花粉萌發(fā)的影響。

1.3 花粉活力試驗

1.3.1 培養(yǎng)基篩選 培養(yǎng)基組分為瓊脂(質量濃度均為10 g/L)、蔗糖、H3BO3，pH均為5.8，取-20 ℃保存的新鮮花粉進行試驗。為研究不同質量濃度蔗糖和H3BO3對蜂糖李、青脆李花粉活力的影響，設計二因子四水平的全因子試驗(表1)及單因素試驗，以篩選蔗糖和H3BO3的最佳質量濃度。

表1 蔗糖和H3BO3對李花粉活力影響的全因子試驗方案Table 1 Experimental design for effects of sucrose and H3BO3 on plum pollen activity g/L

1.3.2 植物生長調節(jié)劑對花粉活力的影響 篩選出最佳培養(yǎng)基組分后，在培養(yǎng)基pH為5.8、培養(yǎng)溫度25 ℃、暗培養(yǎng)時間12 h的條件下，研究植物生長調節(jié)劑NAA、GA3、6-BA對2種李花粉(-20 ℃下保存材料)活力的影響，其中NAA質量濃度設為10，20，30，40 mg/L 4個梯度，GA3質量濃度設為20，30，50，80 mg/L 4個梯度，6-BA質量濃度設為5，10，15，20 mg/L 4個梯度。分別單獨進行單因素試驗，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率并測定花粉管長度，篩選單個植物生長調節(jié)劑的最佳質量濃度。在研究某個植物生長調節(jié)劑時，同時以不加該調節(jié)劑作為對照,NAA、GA3、6-BA對照分別記為CK1、CK2和CK3。

1.3.3 花粉活力測定與分析 采用離體培養(yǎng)萌發(fā)法[8]，將配制好的培養(yǎng)基滴在雙凹載玻片上，凝固后用發(fā)絲進行花粉的均勻播種，將玻片置于有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)12 h后，用OLYMPUS(BX63)顯微鏡于10倍鏡下觀察花粉萌發(fā)情況并測定花粉管長度，將花粉管長度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)[9],計算萌發(fā)率。每處理3次重復，每重復隨機觀察10個視野，每視野觀察50個以上花粉粒，每重復測量15個花粉管長度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析，用Origin 2016繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對蜂糖李花粉活力的影響

由表2可知，蜂糖李和青脆李的花粉萌發(fā)率及花粉管長度在蔗糖、H3BO3及二者交互作用下表現(xiàn)出極顯著差異，說明蔗糖和H3BO3對其花粉活力有明顯的影響。三者對蜂糖李花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響強度分別表現(xiàn)為：蔗糖>蔗糖×H3BO3>H3BO3,蔗糖>H3BO3>蔗糖×H3BO3，說明蔗糖對蜂糖李花粉萌發(fā)和花粉管伸長作用最大；三者對青脆李花粉萌發(fā)和花粉管長度的影響程度分別表現(xiàn)為：蔗糖>蔗糖×H3BO3>H3BO3，H3BO3>蔗糖×H3BO3>蔗糖，說明H3BO3對青脆李花粉管伸長作用更為明顯。

表2 不同質量濃度蔗糖和H3BO3對2種李花粉活力影響的方差分析(主體間效應的檢驗)Table 2 Variance analysis of two plum pollen viability under different concentrations of sucrose and H3BO3(test of effect inter-subjectivity)

不同培養(yǎng)基對2種李花粉活力的影響見表3。由表3可知，蜂糖李花粉萌發(fā)率最高的培養(yǎng)基組分為100 g/L蔗糖+0.20 g/L H3BO3，萌發(fā)率可達61.47%；青脆李花粉萌發(fā)率最高的培養(yǎng)基組分為150 g/L+0.2 g/L H3BO3，萌發(fā)率為68.00%，與培養(yǎng)基為100 g/L蔗糖+0.20 g/L H3BO3的萌發(fā)率無顯著差異，因此認為2種李花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為100 g/L蔗糖+0.20 g/L H3BO3。2種李花粉管伸長的最佳培養(yǎng)基組分均為150 g/L蔗糖+0.10 g/L H3BO3。由表3可知，2種李花粉萌發(fā)率隨著蔗糖質量濃度升高而呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，說明過低或過高質量濃度蔗糖均不利于2種李花粉的萌發(fā)；花粉萌發(fā)率隨H3BO3質量濃度上升總體呈V字形變化。花粉管長度隨蔗糖質量濃度升高而變長，在蔗糖質量濃度為150 g/L時達到峰值，質量濃度繼續(xù)上升花粉管變短；花粉管長度隨H3BO3質量濃度升高逐漸變短，說明高質量濃度H3BO3會抑制花粉管的伸長。

由表3可見，在150 g/L蔗糖+0.10 g/L H3BO3培養(yǎng)基中，2種李花粉管均最長，且該培養(yǎng)條件下的花粉萌發(fā)率與最適花粉萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的花粉萌發(fā)率無顯著差異。綜合考慮，最佳基本培養(yǎng)基組分為150 g/L蔗糖+0.10 g/L H3BO3，在此基礎上進行后續(xù)單因素植物生長調節(jié)劑試驗。

表3 不同培養(yǎng)基對蜂糖李和青脆李花粉萌發(fā)率及花粉管長度的影響Table 3 Effects of different media on germination and pollen tube length of Fengtang and Qingcui plum

2.2 植物生長調節(jié)劑對蜂糖李花粉活力的影響

由表4可知，隨著NAA質量濃度的升高，蜂糖李的萌發(fā)率呈先增大后減小的趨勢，在NAA質量濃度增至20 mg/L時，蜂糖李花粉萌發(fā)率最高，為74.03%，是對照的1.39倍。說明NAA對蜂糖李萌發(fā)的影響作用是雙重的，超出適宜范圍會表現(xiàn)出抑制作用，其最適NAA質量濃度為10～30 mg/L。對青脆李而言，其花粉萌發(fā)率則隨NAA質量濃度的增大而逐漸降低。2種李花粉管長度均隨著NAA質量濃度的升高而變短，說明NAA可以抑制花粉管的伸長，且質量濃度越高抑制作用越顯著?；ǚ勖劝l(fā)過程中，與對照品種青脆李相比，蜂糖李能適應更大質量濃度范圍的NAA。

表4顯示，在本試驗的質量濃度范圍內，GA3均可以極顯著地促進蜂糖李花粉的萌發(fā)。對青脆李而言，在GA3質量濃度為30 mg/L時可以極顯著促進其花粉萌發(fā)。GA3質量濃度為20和50 mg/L時，蜂糖李花粉管長度極顯著長于對照?？傮w而言，本試驗GA3處理對青脆李花粉管長度無顯著影響，但能同時促進蜂糖李花粉萌發(fā)和花粉管生長。

由表4還可知，6-BA質量濃度為5～10 mg/L時，蜂糖李萌發(fā)率均極顯著高于對照，以5 mg/L時的萌發(fā)率最高，為69.68%，比對照提高了38.61%。6-BA質量濃度≥10 mg/L時，青脆李花粉萌發(fā)率均極顯著低于對照。6-BA質量濃度達20 mg/L時，蜂糖李花粉管長度極顯著低于對照，為397.67 μm，比對照降低了63.56%。總體而言，本試驗所有6-BA質量濃度處理抑制了青脆李花粉萌發(fā)和花粉管的生長，而適宜質量濃度的6-BA能促進蜂糖李的花粉萌發(fā)。

表4 植物生長調節(jié)劑對蜂糖李和青脆李花粉萌發(fā)率及花粉管長度的影響Table 4 Effects of plant growth substances on germination and pollen tube length of two plum varieties

2.3 不同貯藏方式對蜂糖李花粉萌發(fā)率的影響

不同貯藏方式對蜂糖李、青脆李花粉萌發(fā)率的影響情況如圖1所示。圖1顯示，不同貯藏條件下，隨貯藏時間的延長，2種李的花粉萌發(fā)率均逐漸降低，但下降速度存在一定差異。4 ℃、-20 ℃和蔗糖密封保存條件下分別保存至5 d時，蜂糖李花粉萌發(fā)率分別降為23.76%，42.75%和43.92%，青脆李分別降為18.29%，38.92%和42.50%。其中均以蔗糖密封保存的花粉萌發(fā)率最高，4 ℃低溫保存最低。說明花粉貯藏前期，萌發(fā)率表現(xiàn)出不穩(wěn)定的狀態(tài)，可能由環(huán)境驟變所導致。在貯藏的10～20 d，4 ℃低溫保存和蔗糖密封保存的2種李花粉萌發(fā)率的下降幅度趨于平緩狀態(tài)；而-20 ℃冷凍保存的花粉萌發(fā)率總體下降速度較快。至20 d時，4 ℃、-20 ℃干燥保存和蔗糖密封保存條件下，與新鮮花粉相比，蜂糖李花粉萌發(fā)率分別下降了62.88%，59.65%和21.72%；青脆李花粉萌發(fā)率分別下降了73.50%，59.77%和25.30%。也以蔗糖密封保存的花粉萌發(fā)率下降幅度最小，說明蔗糖密封保存可有效減小花粉活力的下降速度，延長貯藏時間。蔗糖密封保存到20 d時，蜂糖李花粉萌發(fā)率分別是4 ℃、-20 ℃處理的2.11和1.94倍；青脆李花粉萌發(fā)率分別是4 ℃、-20 ℃處理的2.82和1.86倍。說明蔗糖密封保存是最適宜的李花粉貯藏方式。且不同貯藏方式下，蜂糖李與對照品種青脆李貯藏期間花粉活力的變化趨勢相似。

圖1 不同貯藏方式下蜂糖李(A)和青脆李(B)花粉活力的變化Fig.1 Changes of Fengtang (A) and Qingcui (B) plum pollen germination rate under different storage methods

3 討論與結論

適宜濃度的蔗糖和H3BO3對花粉萌發(fā)和花粉管生長具有明顯促進作用，蔗糖作為營養(yǎng)物質，可在花粉萌發(fā)過程中提供能源，調節(jié)滲透壓[10]。H3BO3能和蔗糖形成絡合物，促進糖分吸收利用[11-12]，還能作為微量元素影響酶的活性，進而參與花粉管壁形成和改變管壁的延展性，促進花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長[13-14]。本試驗研究了蔗糖和H3BO3對蜂糖李與對照品種青脆李花粉活力的影響，結果發(fā)現(xiàn)蔗糖對花粉萌發(fā)和花粉管長度有較大影響?？赡苁且驗檎崽亲鳛槟茉次镔|，在花粉萌發(fā)過程中起主導作用。本試驗表明，促進蜂糖李花粉萌發(fā)和花粉管生長的最適培養(yǎng)基組分為150 g/L蔗糖+0.10 g/L H3BO3，在此培養(yǎng)基下，蜂糖李與對照品種青脆李花粉活力差異不大，說明花粉活力不是蜂糖李結實率低的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，H3BO3質量濃度過高會抑制李花粉管的伸長，可能是其影響了花粉管伸長過程中花粉管壁的酯化果膠脫酯化[15]。孫慧瑛等[16]在杏上也得出相同結論，但與謝鵬等[17]、彭偉秀等[18]、薛曉敏等[19]的研究結論存在差異，這些研究中蔗糖和H3BO3的最適質量濃度各異。這可能與品種遺傳特性、花粉營養(yǎng)狀況、采集時間、培養(yǎng)條件或花粉活力測定方法等有關。

本研究表明，低質量濃度NAA(≤30 mg/L)、6-BA(≤15 mg/L)可以促進蜂糖李花粉萌發(fā)；所有NAA處理及10 mg/L以上的6-BA處理，均能顯著抑制蜂糖李花粉管的生長。說明NAA和6-BA在適宜質量濃度范圍內能明顯提高蜂糖李花粉萌發(fā)率，但超出一定范圍則表現(xiàn)出抑制作用，表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象；而對花粉管生長而言，二者具有較明顯的抑制作用。 周瑞金等[20]在杏梅上的研究也認為，低質量濃度6-BA能促進花粉萌發(fā)，超過一定范圍則表現(xiàn)出抑制作用；而李學強等[7]在歐李上的研究則認為，低質量濃度NAA對花粉萌發(fā)和花粉管生長無明顯促進作用；6-BA會抑制萌發(fā)，但適宜質量濃度可以促進花粉管伸長。這些研究成果說明，NAA、6-BA在不同植物上的影響效果存在較大差異。本試驗中NAA和6-BA處理對青脆李的花粉萌發(fā)和花粉管伸長無促進作用，這與劉佳等[21]的研究結論相似。在本研究質量濃度范圍內，GA3均可以顯著促進蜂糖李花粉萌發(fā)，且其質量濃度為20，50 mg/L時對花粉管長度也有極顯著促進作用，這與Sun等[22]在杏上的研究結論相似。需提出的是，本試驗對GA3質量濃度設置存在欠缺，還應擴大濃度梯度范圍，以篩選出抑制蜂糖李花粉萌發(fā)和花粉管伸長的GA3質量濃度。

只有較高萌發(fā)率和較長的花粉管才能保證植物最終的結實率，因此要綜合考慮花粉萌發(fā)率和花粉管長度，才能更為準確地評價花粉活力。花粉萌發(fā)是植物授粉受精的前提條件，花粉管的長度最終決定受精過程能否順利完成。以花粉管長度為重點觀察指標，更能準確評價花粉活力的強度。因此，在最適花粉萌發(fā)和花粉管生長的培養(yǎng)基組分上，添加質量濃度20或50 mg/L的GA3配成營養(yǎng)液，在蜂糖李花期進行噴施，可能可以提高蜂糖李的授粉受精成功率。但這是實驗室得出的結論，具體效果還得進行田間試驗，且噴施次數(shù)和間隔時間、營養(yǎng)液的pH等田間試驗影響因素也應加以考慮。

花粉貯藏過程中依然在進行微弱的代謝生理活動，不斷消耗花粉內的原有營養(yǎng)物質，進而導致花粉萌發(fā)率不斷下降[23]?；ǚ刍盍ο陆邓俣扰c貯藏條件有密切關系，其中貯藏溫度是影響花粉壽命的重要因素。許多研究表明，降低貯藏溫度可有效延長花粉的壽命[24]。本研究也表明，冷凍保存較低溫保存更能延長花粉壽命，可能是更低的溫度降低了花粉的呼吸強度，導致代謝速度緩慢，減少了糖類、礦質營養(yǎng)和有機酸等的消耗，從而延長了花粉壽命。對大多數(shù)植物花粉來說，濕度也是影響花粉活力的重要因素[25-27]，本試驗采用蔗糖密封保存研究了花粉貯藏過程中環(huán)境濕度的影響，結果表明蔗糖密封保存能有效提高貯藏過程中的花粉活力?；ǚ勖劝l(fā)過程中蔗糖作為能量源，能補充花粉貯藏過程可溶性糖類物質的消耗，同時使花粉貯藏的環(huán)境濕度維持在一個穩(wěn)定合適的狀態(tài)。綜合分析，李花粉的保存以蔗糖密封保存效果最為理想，這不但能有效降低花粉萌發(fā)率的下降速度，延長貯藏時間,而且因可常溫保存，在異地雜交時攜帶方便，田間操作性和靈活性更強。但關于蔗糖維持貯藏環(huán)境相對濕度的適宜范圍，以及其是否補充了花粉貯藏過程中糖類物質的消耗等，均有待進一步研究。