培養(yǎng)液充氣時間對小鼠4細胞胚胎密閉培養(yǎng)效果的影響

劉 潔，王丹丹，陳 芳，谷建鋒，王 兆，趙曉娥，馬保華

(西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，農業(yè)部動物生物技術重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

近年來，隨著一系列太空探測計劃的實施和發(fā)展，空間科學研究成為各國競爭日趨激烈的領域。隨著載人飛行器的誕生，空間飛行對機體的影響，尤其是對生殖系統(tǒng)、胚胎發(fā)育的影響是值得關注和研究的課題[1-2]。在空間胚胎發(fā)育研究中，由于空間的微重力條件，胚胎培養(yǎng)必須采用密閉培養(yǎng)的方式進行[3]。密閉培養(yǎng)體系須在培養(yǎng)前對培養(yǎng)液進行一次性充氣，胚胎發(fā)育的氧氣來源完全依賴于密閉培養(yǎng)體系[4]。因此，適宜的充氣時間對密閉胚胎的培養(yǎng)至關重要。

本試驗在前期對小鼠4細胞胚胎研究的基礎上[5]，使用氣體為體積分數5% O2、5% CO2、90% N2的標準氣對胚胎培養(yǎng)液持續(xù)充氣不同時間后，進行小鼠4細胞胚胎密閉培養(yǎng)，通過檢測密閉培養(yǎng)過程中胚胎過氧化物產生和缺氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factors-1α,HIF-1α)累積的情況，以及對囊胚發(fā)育率、孵化率及囊胚總細胞數進行統(tǒng)計，確定適宜于小鼠早期胚胎密閉培養(yǎng)的培養(yǎng)液標準氣充氣時間，為空間環(huán)境下哺乳動物的早期胚胎發(fā)育研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物 健康普通級昆明系小鼠(Musmusculus)，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，飼養(yǎng)室溫度18～22 ℃，07:00-20:00日光燈人工光照，20:00-07:00黑暗，自由采食、飲水。在雌鼠體質量達到25 g左右、雄鼠體質量達到35 g左右時用于試驗。

1.1.2 主要試劑和儀器 孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG),寧波第二激素廠產品；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，美國Invitrogen公司產品；兔源多克隆HIF-1α抗體和2′7′-二氯二氫熒光素二乙酯(2′7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFDA)，英國Abcam公司產品；生物素標記的羊抗兔IgG、鏈霉菌抗生物素過氧化物酶、DAB顯色試劑盒，福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產品；免疫染色固定液、免疫染色封閉液、免疫染色一抗稀釋液、免疫染色二抗稀釋液、抗熒光淬滅封片劑，碧云天生物技術研究所產品；高純標準氣(氣體組成為體積分數5% O2、5% CO2、90% N2)，北京龍輝京城氣體有限公司產品；體視顯微鏡(SZ61)和數碼倒置熒光顯微鏡(IX71-FL/RC)，日本Olympus公司產品；超凈工作臺(HD-1360)，北京東聯哈爾濱儀器公司產品；CO2培養(yǎng)箱(FORMA 3111)，美國Thermo Scientific公司產品；超純水儀(UPT-1)，成都超純水科技有限公司產品。

1.1.3 液體配制 胚胎操作液：添加體積分數5% FBS的改良杜氏磷酸鹽緩沖液(modified Dulbecco’s phosphate buffer solution，mDPBS)。胚胎培養(yǎng)液：添加體積分數10% FBS的CZB液。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠超數排卵處理及胚胎采集 小鼠超數排卵處理及胚胎采集參照劉潔[3]的方法進行，具體操作如下：選擇陰道口黏膜輕微紅腫，陰道口緊閉、潔凈，陰道內壁為粉紅色且濕潤的雌性小鼠，于超數排卵當天(第0天)16:00每只小鼠腹腔注射PMSG 10 IU，48 h后(第2天)腹腔注射hCG 10 IU，隨即將雌鼠與單籠飼養(yǎng)的雄鼠合籠(雌雄比例1∶1)，次日(第3天)上午07:00觀察其陰門栓形成情況，有陰門栓形成者為假定受孕母鼠，用于胚胎采集。第4天晚23:00，頸椎脫臼法處死假定受孕母鼠，無菌采集輸卵管，在盛有胚胎操作液的表面皿內，用無菌注射針頭撕裂輸卵管，收集4細胞胚胎，用新鮮胚胎操作液進行胚胎凈化處理和形態(tài)質量鑒定后，挑選形態(tài)質量合格者用于體外培養(yǎng)試驗。

1.2.2 胚胎培養(yǎng) 胚胎培養(yǎng)參照谷建鋒等[5]的方法進行，具體操作如下。

(1)胚胎常規(guī)微滴培養(yǎng)。每個培養(yǎng)液微滴體積為100 μL，于胚胎培養(yǎng)前在35 mm培養(yǎng)皿內用胚胎培養(yǎng)液制作微滴，上覆礦物油，置入CO2培養(yǎng)箱中預平衡2 h，培養(yǎng)前將50枚胚胎移入微滴，置入飽和濕度、37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，在胚胎培養(yǎng)的12,36,60和84 h取樣，備檢。

(2)胚胎密閉培養(yǎng)。在胚胎密閉培養(yǎng)前，用100 mL無菌玻璃瓶裝40 mL培養(yǎng)液，將高純標準氣通入胚胎培養(yǎng)液底部進行緩慢充氣，減壓氣體與培養(yǎng)液之間的連接管道上用氣體細菌濾器二次過濾除菌，充氣速度以每分鐘形成180～200個連續(xù)小氣泡為度。各密閉培養(yǎng)組培養(yǎng)液充氣時間分別為30,60,90,120,150,180和240 min，充氣后的培養(yǎng)液立即用于胚胎密閉培養(yǎng)。使用200 μL PCR管(Axygen)作為胚胎培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時先用充氣胚胎培養(yǎng)液將PCR管潤洗3次，隨即加入200 μL充氣培養(yǎng)液，并立刻移入100枚小鼠4細胞胚胎，蓋緊PCR管蓋并快速翻轉PCR管使管口向下、浸入熔化的石蠟中并迅速離開和翻轉，對PCR管進行石蠟封口，以保證胚胎培養(yǎng)環(huán)境的氣密和液密。將密封好的PCR管放入飽和濕度、溫度37 ℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，于培養(yǎng)的12，36，60和84 h取樣，備檢。

1.2.3 胚胎內氧自由基產生情況的檢測 利用DCFDA染色技術檢測培養(yǎng)胚胎中過氧化物的產生和積累水平。首先對各充氣時間組密閉培養(yǎng)12 h的胚胎過氧化物產生和累積情況進行檢測，結果為陽性者在下一個時間點繼續(xù)檢測，依次向后直至檢測結果呈陰性，每個培養(yǎng)管檢測9～13枚胚胎。檢測方法參照劉潔[2]的方法進行。操作時，打開PCR管蓋，加入含0.5% DCFDA的PBS，使DCFDA的質量濃度為25 μg/mL，并輕輕吹打混勻，蓋上管蓋，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，取出后避光，用細胞核染液(含10 μg/mL Hoechst 33342的PBS)染核3 min，用PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察，通過比較各組胚胎中綠色熒光的強弱，判斷胚胎中氧自由基產生和積累的情況。

1.2.4 HIF-1α蛋白表達的檢測 首先對各組培養(yǎng)84 h的胚胎HIF-1α蛋白水平進行檢測，結果為陽性者繼續(xù)檢測上一個時間點的樣品，直至檢測結果呈陰性時為止，每個培養(yǎng)管檢測9～13枚胚胎。檢測方法參照劉潔[3]的方法進行。檢測時，對停止培養(yǎng)的胚胎室溫固定1 h，免疫染色封閉液中封閉1 h，兔源多克隆HIF-1α抗體中(1∶1 000倍稀釋)4 ℃孵育16 h，生物素標記的羊抗兔IgG室溫孵育10 min，鏈霉素抗生物素過氧化物酶室溫處理10 min，最后用DAB顯色試劑盒進行顯色處理，進行上述每一步操作前均需使用PBS清洗胚胎3次。將顯色處理后的胚胎逐個置于載玻片上，用梯度酒精(體積分數依次為70%，80%，95%，100%)脫水干燥，二甲苯透明，封片。于顯微鏡下觀察胚胎的著色情況，有明顯的棕色著色即表示其為HIF-1α蛋白表達陽性胚胎。

1.2.5 囊胚細胞計數 各組胚胎培養(yǎng)至84 h停止培養(yǎng)，觀察胚胎發(fā)育情況并拍照。計算各組囊胚發(fā)育率和孵化率，并進行囊胚細胞計數。計數時，先將各組囊胚在室溫條件下固定30 min，然后隨機選取9～13枚胚胎，將胚胎移入細胞核染液中處理5 min，PBS洗3次×5 min后，置于載玻片上，滴加抗熒光淬滅封片劑；加蓋蓋玻片并用指甲油封片，壓片置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計胚胎總細胞數。

1.2.6 數據統(tǒng)計與分析 為減小試驗誤差，各組試驗均重復3次。試驗所得數據用SPSS 20.0軟件進行組間差異顯著性的單因素方差分析，結果用“平均值(Mean)±標準誤(SE)”表示。

2 結果與分析

2.1 小鼠胚胎培養(yǎng)過程中過氧化物的檢測

常規(guī)微滴培養(yǎng)小鼠胚胎各個時間節(jié)點的過氧化物檢測結果均為陰性。密閉培養(yǎng)小鼠胚胎過氧化物的檢測結果(圖1)顯示，培養(yǎng)液充氣30,60,90,120,150 min的密閉培養(yǎng)組胚胎，體外培養(yǎng)12 h時過氧化物檢測為陰性(未見綠色熒光)；充氣180 min組和240 min組胚胎密閉培養(yǎng)12 h時，經DCFDA處理后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，且充氣240 min組更為明顯,繼續(xù)培養(yǎng)至36 h時兩組均未觀察到綠色熒光。

2.2 小鼠胚胎培養(yǎng)過程中HIF-1α蛋白表達的檢測

充氣培養(yǎng)液密閉培養(yǎng)胚胎和常規(guī)微滴培養(yǎng)胚胎免疫組化染色結果見圖2。

A.藍色亮點為Hoechst 33342所染的細胞核；B.DCFDA染色結果，更強的綠色熒光代表更多過氧化物在胚胎內產生1.在微滴中培養(yǎng)12 h的胚胎(對照組); 2～8.分別為培養(yǎng)液充氣30,60,90,120,150,180,240 min 組密閉培養(yǎng)12 h的胚胎；9,10.分別為培養(yǎng)液充氣180和240 min組密閉培養(yǎng)36 h的胚胎。標尺=20 μmA.Bluish fluorescence shows nucleus stained by Hoechst 33342;B.Peroxide is labeled with DCFDA,stronger green fluorescence means more ROS was produced in embryo.1.Embryos cultured for 12 h in microdrop (control);2-8.Embryos cultured for 12 h in sealed-culture groups pretreated with reference gas for 30,60,90,120,150,180 and 240 min,respectively;9 and 10.Embryos cultured for 36 h in sealed-culture groups pretreated with reference gas for 180 and 240 min.Scale bar=20 μm圖1 體外充氣密閉培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)小鼠早期胚胎中過氧化物水平的檢測結果Fig.1 ROS levels of early-stage embryos cultured in microdrop or sealed-culture groups in vitro

A.常規(guī)微滴培養(yǎng)84 h的胚胎(對照組)；B1.充氣30 min密閉培養(yǎng)12 h的胚胎；B2.充氣60 min密閉培養(yǎng)36 h的胚胎；B3.充氣90 min密閉培養(yǎng)60 h的胚胎；B4-B7.分別為充氣120,150,180,240 min密閉培養(yǎng)84 h的胚胎HIF-1α檢測陽性的胚胎細胞顯棕色，陰性胚胎無特異性著色;標尺=20 μmA.Embryo cultured for 84 h in microdrop group (control);B1.Embryo cultured for 12 h in the sealed-culture group pretreated with reference gas for 30 min;B2.Embryo cultured for 36 h in the sealed-culture group pretreated with reference gas for 60 min;B3.Embryo cultured for 60 h in the sealed-culture group pretreated with reference gas for 90 min;B4-B7.Embryos cultured for 84 h in the groups pretreated reference gas for 120,150,180,and 240 min,respectively.Embryos that tested positive for HIF-1α were brown,and those negative had no obvious staining;scale bar=20 μm圖2 體外充氣密閉培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)小鼠早期胚胎中HIF-1α蛋白累積情況的檢測結果(DAB顯色)Fig.2 Accumulation of HIF-1α protein in early-stage embryos cultured in microdrop or sealed-culture groups in vitro (staining by DAB)

如圖2-A所示，常規(guī)微滴培養(yǎng)組小鼠胚胎在培養(yǎng)過程中均未檢測到HIF-1α蛋白累積。用充氣30 min的培養(yǎng)液進行密閉培養(yǎng)的小鼠胚胎，在培養(yǎng)到12 h時胚胎細胞即表現明顯的淺棕色團塊狀著色，表明HIF-1α已經開始出現積累(圖2-B1)；充氣60 min組的胚胎在密閉培養(yǎng)36 h時檢測到HIF-1α的積累(圖2-B2)；充氣90 min組的胚胎在培養(yǎng)60 h時檢測到HIF-1α的積累(圖2-B3)；充氣120 min組的胚胎在培養(yǎng)84 h時檢測到HIF-1α的積累(圖2-B4)；充氣150，180，240 min組的胚胎，直至培養(yǎng)結束時都未檢測到HIF-1α的積累。

體外培養(yǎng)12和36 h的胚胎，由于細胞數較少，免疫組化染色處理后，胚胎呈不規(guī)則凹多邊形(圖2-B1,B2)。

2.3 小鼠胚胎體外發(fā)育情況及囊胚細胞計數結果

充氣密閉培養(yǎng)及常規(guī)微滴培養(yǎng)84 h后，小鼠胚胎體外發(fā)育及囊胚細胞計數結果(圖3，表1)顯示，充氣30和60 min密閉培養(yǎng)的小鼠胚胎囊胚發(fā)育率很低，有卵裂球碎裂、縮小等現象；充氣120 min以上各組均可獲得較高的囊胚發(fā)育率，且各組間均無顯著差異(P>0.05)；充氣30～90 min密閉培養(yǎng)各組和常規(guī)微滴培養(yǎng)組的囊胚孵化率均顯著低于充氣120～240 min密閉培養(yǎng)各組(P<0.05)，其中充氣90 min密閉培養(yǎng)組的囊胚發(fā)育率亦顯著低于充氣120～240 min密閉培養(yǎng)各組(P<0.05)。小鼠胚胎細胞計數結果顯示，微滴培養(yǎng)組和充氣120，150，180 min密閉培養(yǎng)組胚胎的平均總細胞數差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他組(P<0.05)。

A.常規(guī)微滴培養(yǎng)84 h的胚胎對照組；B-H.分別為充氣30,60,90,120,150,180,240 min密閉培養(yǎng)組胚胎。標尺=50 μmA.Embryo cultured for 84 h in microdrop (control);B-H.Embryos in sealed-culture groups pretreated with reference gas for 30,60,90,120,150,180,and 240 min,respectively.Scale bar=50 μm圖3 小鼠4細胞胚胎體外充氣密閉培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)84 h后獲得的囊胚Fig.3 Blastocysts obtained 84 h after mouse 4 cell stage embryos cultured in microdrop or sealed-culture groups in vitro

表1 小鼠4細胞胚胎體外密閉培養(yǎng)和微滴培養(yǎng)84 h的發(fā)育情況及細胞計數結果Table 1 Developmental rates and total cell numbers of mouse 4 cell embryos cultured in microdrop or sealed-culture groups for 84 h

3 討 論

前人對倉鼠、家兔、獼猴等動物的研究結果顯示，子宮與輸卵管腔中的氧氣體積分數為2%～9%[6]。研究證明，當胚胎培養(yǎng)體系中的氧氣體積分數較低(約5%)時，其囊胚發(fā)育率高于在大氣氧環(huán)境下(約20%)培養(yǎng)的胚胎[7-11]，究其原因，可能與氧自由基對胚胎的損傷有關[12-14]。然而，胚胎培養(yǎng)環(huán)境中的氧含量過低，又會導致胚胎缺氧，同樣對胚胎發(fā)育產生不良影響[4]。在進行小鼠胚胎密閉培養(yǎng)時，胚胎發(fā)育所需的氧氣完全依賴于密閉培養(yǎng)體系，而對培養(yǎng)液進行充氣處理的時間直接影響了培養(yǎng)液中的溶氧量。因此，篩選出適宜的培養(yǎng)液充氣時間，對于建立和完善小鼠胚胎密閉培養(yǎng)體系十分重要。

本研究中對小鼠胚胎氧自由基產生的檢測結果表明，培養(yǎng)液充氣時間≤150 min時，胚胎在培養(yǎng)12，36，60，84 h時均未檢測到氧自由基的累積；培養(yǎng)液充氣180和240 min，胚胎密閉培養(yǎng)12 h時檢測到了過氧化物，且充氣240 min組更為明顯，提示充氣時間過長會使培養(yǎng)液的溶氧量超過胚胎正常發(fā)育的氧消耗量，導致胚胎在培養(yǎng)過程中積累過量的活性氧基團。在對胚胎質量進行綜合評價后發(fā)現，盡管充氣時間在120～240 min的密閉培養(yǎng)各組在囊胚發(fā)育率和孵化率上差異不顯著(P>0.05)，但培養(yǎng)液充氣240 min的密閉培養(yǎng)組囊胚細胞總數顯著低于充氣120～180 min的密閉培養(yǎng)組。這一結果說明在小鼠胚胎培養(yǎng)初期，胚胎中過多的氧自由基在一定程度上會對胚胎發(fā)育產生不利影響。同時，在本研究中，微滴培養(yǎng)組的囊胚孵化率顯著低于培養(yǎng)液充氣120～240 min的密閉培養(yǎng)組，可能與微滴培養(yǎng)時胚胎始終暴露在相對較高的氧環(huán)境中有關。研究者對倉鼠、家兔、獼猴等動物的研究結果顯示，子宮腔的氧氣濃度略低于輸卵管，表明在生理條件下，胚胎發(fā)育原本就經歷著一個從相對高氧到相對低氧的過程[15]。有研究者認為，將早期胚胎持續(xù)暴露于20%的高氧環(huán)境下，會出現囊胚發(fā)育率降低、胚胎形態(tài)差異過大以及植入異常等現象[16]。此外，在微滴培養(yǎng)組的胚胎中并未檢測到過氧化物的積累，提示當充氣時間超過180 min后，溶解在充氣培養(yǎng)液中的氧氣總量可能已經超過了在大氣環(huán)境下液體中的溶氧量。

HIF-1由α和β兩個亞基構成，在哺乳動物細胞中能夠穩(wěn)定表達，并在氧充足的環(huán)境中快速被泛素化降解。但在缺氧環(huán)境下，HIF-1的泛素化降解通路受阻，導致其在細胞中出現累積[17-19]。因此，HIF-1α能夠作為檢驗細胞是否缺氧的指標物。在密閉培養(yǎng)體系中，胚胎發(fā)育所需的氧氣由充氣培養(yǎng)液提供，在培養(yǎng)過程中無法向體系中補充氧氣。因此在對培養(yǎng)液充氣處理時，需要保證培養(yǎng)液中充入了足夠支持細胞發(fā)育到囊胚的氧氣。在對各組小鼠胚胎HIF-1α蛋白檢測后發(fā)現，在培養(yǎng)液充氣時間為150,180和240 min的密閉培養(yǎng)組中，培養(yǎng)84 h后胚胎中HIF-1α蛋白檢測仍呈陰性，提示這3組的胚胎在發(fā)育過程中處于不缺氧的狀態(tài)，因此培養(yǎng)終止時在胚胎中未檢測到HIF-1α[20]。培養(yǎng)液充氣120 min的密閉培養(yǎng)組胚胎的HIF-1α累積在60 h時檢測為陰性，在84 h時檢測為陽性，提示在此密閉培養(yǎng)組中，培養(yǎng)液中的溶氧量能支持胚胎發(fā)育60 h以上；進一步對該組的囊胚發(fā)育率、孵化率和囊胚細胞計數結果進行評定，認為雖然該組胚胎在培養(yǎng)末期發(fā)生了缺氧現象，但并未對胚胎發(fā)育造成可見的不利影響。培養(yǎng)液充氣90，60，30 min組胚胎在密閉培養(yǎng)早期即出現HIF-1α積累，表明胚胎在早期發(fā)育過程中即處于缺氧環(huán)境，HIF-1翻譯后降解受阻[21]。有研究報道，在缺氧條件下，HIF-1α調高p53的表達量并誘導合成p21，以抑制細胞周期依賴激酶的活性，同時使細胞周期停留在G1期，促使細胞凋亡[22]，因此導致了培養(yǎng)液充氣30，60，90 min組密閉培養(yǎng)的部分胚胎出現發(fā)育停滯和退化的現象。

4 結 論

在使用氣體組成為體積分數5% O2、5% CO2和90% N2標準氣的密閉培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)液充氣時間為120～150 min時，密閉培養(yǎng)體系中的胚胎在發(fā)育早期不會受到過多的活性氧損傷，在發(fā)育的后期也可盡量減少缺氧對胚胎發(fā)育的不利影響。據此認為，充氣120～150 min的胚胎密閉培養(yǎng)條件可較好地支持小鼠4細胞胚胎體外發(fā)育至囊胚和孵化囊胚階段。