巨菌草根際土壤微生物群落代謝功能多樣性分析

翁志強(qiáng)，許鈺瀅，呂正陽(yáng)，劉 娟，王 哲，蔡楊星，王榮波，葉文雨

（1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心/福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建 福州 350002）

【研究意義】土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的分解者和土壤有機(jī)質(zhì)循環(huán)的主要?jiǎng)恿?，它參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)過(guò)程，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在植物養(yǎng)分供應(yīng)和生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［1-3］。土壤微生物分解有機(jī)質(zhì)，增加土壤養(yǎng)分，為植物的生長(zhǎng)提供養(yǎng)分。同時(shí)，土壤微生物對(duì)土壤理化性質(zhì)也有一定的影響。所以土壤微生物的數(shù)量種類與土壤肥力的高低具有一定的聯(lián)系［4-5］。巨菌草（Pennisetum giganteumJUJUNCAO）隸屬禾本科狼尾草屬（Pennisetum），是福建農(nóng)林大學(xué)林占熺教授引進(jìn)并選育的一類草本植物，巨菌草是致富草、治沙草、脫貧草、友誼草，已經(jīng)幫助一些非洲國(guó)家突破了農(nóng)業(yè)發(fā)展瓶頸。巨菌草具有廣泛用途，如食藥用菌栽培、飼養(yǎng)牛羊、防風(fēng)固沙、生物質(zhì)能源制備、造紙等，對(duì)其根際土壤展開土壤微生物群落的功能多樣性的研究，有助于對(duì)其進(jìn)行更為合理的種植與利用［6-12］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤微生物群落在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，土壤微生物促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，植物為土壤微生物提供營(yíng)養(yǎng)。Biolog-ECO 微平板具有31 種碳源，96 孔板3 次重復(fù)，根據(jù)微生物對(duì)不同碳源的利用程度來(lái)研究土壤微生物的功能多樣性。Biolog 技術(shù)是研究土壤微生物群落的功能多樣性的簡(jiǎn)單、快速方法之一，越來(lái)越多的科研工作者使用該技術(shù)。目前，Biolog 技術(shù)已經(jīng)用于植物、果園、油田、礦區(qū)等林業(yè)、花卉等根際土壤微生物的研究。前人對(duì)巨菌草進(jìn)行了栽培等方面的研究，對(duì)巨菌草根際土壤微生物的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道［13-15］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】將巨菌草根際土作為研究對(duì)象，開展其微生物群落功能多樣性的研究，探討適宜巨菌草自然生長(zhǎng)的立地條件，為巨菌草及其他植物的生長(zhǎng)提供理論依據(jù)，以期為更好地經(jīng)營(yíng)管理植物提供新的思路和基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)對(duì)平潭試驗(yàn)基地巨菌草根際土壤與非根際土壤不同碳源利用，揭示根際土壤微生物群落功能的多樣性，促進(jìn)巨菌草產(chǎn)業(yè)化種植，保護(hù)生態(tài)，同時(shí)為巨菌草生態(tài)治理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤樣品采自福州平潭實(shí)驗(yàn)基地巨菌草根際土與非根際土壤。土壤為砂質(zhì)土壤，保水性能差，保肥性能弱。

主要儀器設(shè)備：酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀SpectraMaxi3（美谷分子儀器（上海）有限公司）、八通道移液器（Eppendorf AG）、Biolog-Eco 生態(tài)板（美國(guó)Biolog 公司）、生化培養(yǎng)箱（寧波海螺賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）、UNIQUE-R20 純水機(jī)（銳思捷科學(xué)儀器有限公司）、超凈工作臺(tái)ZHJH-C1214B（廈門德維科技有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤樣品的采集 在每塊樣地內(nèi)以S 型采樣法選取5 個(gè)采樣點(diǎn)，用土鉆采集根際土和非根際土壤樣品，混合后裝入已滅菌的土壤袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后1 d 內(nèi)進(jìn)行分析［16］。

1.2.2 巨菌草根際土及其對(duì)照土壤微生物群落多樣性分析 采用Biolog-ECO 技術(shù)對(duì)土壤微生物群落功能及代謝多樣性進(jìn)行分析，利用酶標(biāo)儀在590 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定和數(shù)據(jù)讀取，分析其多樣性，3 次重復(fù)。生態(tài)板31 種碳源分為6 類：羧酸類7 種、多聚合物類4 種、糖類10 種、酚類2 種、氨基酸類4 種、胺類2 種。具體方法：稱取10 g 新鮮根際土壤，加入盛有100 mL、0.85%NaCl 溶液的三角瓶中，搖床280 r/min，振蕩30 min，取出后冰浴靜置2 min，用0.85% NaCl溶液梯度稀釋至1 000 倍。用移液器將上述稀釋液加入Biolog-Eco 微平板中，每孔加150 μL，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h 使用酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，共記錄7 d［17］。

將每次讀板得到的吸光值減去對(duì)照（培養(yǎng)0 h）孔的吸光值，以去除本底干擾，負(fù)值全部歸0。分別計(jì)算31 個(gè)孔中碳源的平均顏色變化率（Average well color development，AWCD）和培養(yǎng)144 h 的數(shù)據(jù)進(jìn)行土壤微生物多樣性分析。

式中，C 為生態(tài)板中微孔的吸光度值（590 nm），R 為生態(tài)板中空白對(duì)照孔的光密度值，n 為底物數(shù)量（Eco 板，n=31）。

Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、Pielou 均勻度指數(shù)等采用DPS（7.05）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。以培養(yǎng)144 h 的數(shù)據(jù)進(jìn)行碳源代謝和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物群落平均顏色變化率（AWCD）

AWCD 值反映了巨菌草根際土壤樣品中微生物群落對(duì)碳源利用的整體情況和代謝活性。分別培養(yǎng)巨菌草根際土壤及其對(duì)照的微生物在0、24、48、72、96、120、144 h 共7 個(gè)時(shí)段的碳源利用情況，巨菌草根際土壤及其對(duì)照的微生物對(duì)碳源利用在144 h 后趨于平緩。從圖1 可以看出，無(wú)論是巨菌草根際土壤還是其對(duì)照土壤，微生物群落在0～48 h 時(shí)段對(duì)碳源的利用最低，在144 h對(duì)碳源的利用趨于平緩，因此選擇144 h 的吸光值作為計(jì)算微生物群落多樣性的指標(biāo)值。巨菌草根際土壤AWCD 值明顯高于對(duì)照土樣品，說(shuō)明巨菌草根際土壤微生物對(duì)碳源的利用程度大于對(duì)照土壤。

圖1 巨菌草根際土壤與非根際土壤微生物碳源利用Fig.1 Carbon source utilization of microorganisms in rhizophere and non-rhizosphere soils of Pennisetum giganteum

2.2 巨菌草根際土與非根際土壤微生物群落功能多樣性分析

Shannon 多樣性指數(shù)是均勻度和豐富度的綜合指標(biāo)，Simpson 多樣性指數(shù)值越大，表示多樣性程度越高，Shannon 多樣性指數(shù)值越大，表示群落多樣性越大。由表1 可知，巨菌草根際土壤的Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)、Brillouin 多樣性指數(shù)、Pielou 均勻度指數(shù)比非根際土壤略大，表明巨菌草根際土壤微生物的群落多樣性程度高。

表1 巨菌草根際土壤及其對(duì)照土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 1 Diversity indexes of microbial communities in rhizophere and control soils of Pennisetum giganteum

2.3 根際土壤微生物群落利用碳源情況

表2 為巨菌草根際土與非根際土壤樣品144 h 各類碳源利用情況。巨菌草根際土壤微生物群落不能利用的碳源有L-蘇氨酸、2-羥基苯甲酸、α-丁酮酸、D-蘋果酸、α-D-乳糖、1-磷酸葡萄糖等碳源，其非根際土壤不能利用的碳源有腐胺、1-磷酸葡萄糖等碳源。

表2 巨菌草根際土壤及其對(duì)照土壤微生物對(duì)BIOLOG-Eco 板上碳源的利用情況Table 2 Vtilization of Carbon sources on BIOLOG-Eco plate of microorganisms in rhizophere and control soils of Pennisetum giganteum

2.4 土壤微生物群落利用碳源主成分分析

運(yùn)用SPSS19.0 軟件采取降維的方法，基于培養(yǎng)144 h 的AWCD 值進(jìn)行樣品土壤微生物利用碳源的主成分分析。

PCA1 解釋變量方差的54.727%，PCA2 解釋變量方差的45.273%，說(shuō)明PCA1 對(duì)群落的貢獻(xiàn)略大。第一主成分與第二主成分貢獻(xiàn)率之和達(dá)到100%，說(shuō)明提取的PCA1 和PCA2 主成分可以反映土壤微生物對(duì)6 類碳源的利用情況（表3）。

表3 巨菌草根際土壤及其對(duì)照土壤微生物群落碳源利用主成分分析Table 3 PCA on carbon source utilization of microbial communities in rhizophere and control soils of Pennisetum giganteum

31 種碳源對(duì)PC1 和PC2 貢獻(xiàn)的特征向量系數(shù)反映了單一碳源對(duì)PC1 和PC2 的貢獻(xiàn)（圖2）,由圖2 可知,對(duì)PC1 貢獻(xiàn)大的碳源（系數(shù)＞0.50）有22 種,其中糖類8 種（β-甲基-D-葡萄糖苷、D,L-α-磷酸甘油、D-半乳糖酸γ-內(nèi)酯、1-磷酸葡萄糖、α-D-乳糖、D-甘露醇、D-木糖、N-乙酰-D 葡萄糖氨），羧酸類占5 種（D-蘋果酸、D-葡糖胺酸、衣康酸、D-半乳糖醛酸、γ-羥丁酸），氨基酸類3 種（L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-天門冬酰胺），多聚物3 種（吐溫40、吐溫80、α-環(huán)式糊精），胺類2 種（腐胺、苯乙胺），酚酸類1 種（4-羥基苯甲酸）?？梢娪绊慞C1 的主要為糖類和羧酸類；對(duì)PC2 貢獻(xiàn)大的碳源有7 種,其中酚酸類2 種（2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸）,糖類1 種（D-纖維二糖），氨基酸類3 種（L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸）?？梢娪绊慞C2 的主要為氨基酸類。4-羥基苯甲酸和L-苯丙氨酸對(duì)PC1 和PC2 貢獻(xiàn)系數(shù)都＞0.50。

圖2 31 種碳源對(duì)PC1 和PC2 貢獻(xiàn)的特征向量系數(shù)Fig.2 Eigenvector coefficients of 31 carbon sources with loadings for PCA1 and PCA2

3 討論

巨菌草具有獨(dú)特生態(tài)功能，根際微生物群落對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)性密切相關(guān)。Biolog-Eco技術(shù)是研究土壤微生物多樣性的技術(shù)手段之一，采用該技術(shù)研究菌草根際土壤微生物群落功能多樣性，有助于探尋巨菌草最適生長(zhǎng)條件。環(huán)境條件、植被、土壤肥力、物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化都與土壤微生物的活性有極大的相關(guān)性，土壤微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)的主動(dòng)力［20-24］。在利用Biolog-Eco生態(tài)板技術(shù)研究土壤微生物群落代謝活性時(shí)，如果 AWCD（平均顏色變化率）值越高，說(shuō)明土壤微生物群落代謝活性就高，反之，說(shuō)明其微生物群落代謝活性低［25］。本研究中，巨菌草根際土壤各時(shí)段的AWCD 值均高于非根際土壤，這表明巨菌草根際土壤微生物的代謝活性高于非根際土壤，同時(shí)也說(shuō)明對(duì)碳源的利用程度也高于非根際土壤。一方面由于巨菌草植株高大，根系發(fā)達(dá)等特點(diǎn)，為土壤微生物創(chuàng)造了良好的生存環(huán)境，有利于土壤微生物群落多樣性和功能多樣性的形成。但是巨菌草根際土壤微生物活性的提高是否會(huì)影響巨菌草及其他植物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)也未做相關(guān)研究。哪一類微生物對(duì)巨菌草的影響是顯著的也是值得進(jìn)一步的研究。

土壤微生物對(duì)不同碳源利用能力的差異可以在一定程度上指示土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成［26］。本實(shí)驗(yàn)碳源利用分析結(jié)果表明，巨菌草根際土壤微生物群落能利用六大類（糖類、多聚物類、氨基酸類、羧酸類、胺類和酚酸類）碳源，其生理活性高于非根際土壤，提高了對(duì)碳源的利用。這可能是由于巨菌草植株殘?bào)w為土壤微生物群落提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)一步造成了土壤微生物生境不同，進(jìn)而造成微生物群落利用碳源的不同，這種解釋有待于進(jìn)一步用培養(yǎng)基培養(yǎng)法分離微生物進(jìn)行驗(yàn)證。

平潭菌草試驗(yàn)基地地處沙漠區(qū)，種植菌草后沙漠變綠洲，這在一定程度上改善了當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境條件。土壤微生物多樣性指數(shù)比較分析表明，巨菌草根際土壤微生物的Pielou 指數(shù)、Shannon指數(shù)、Brillouin 指數(shù)高于非根際土壤，但差異不顯著。這可能是由于植物根系分泌物不同所致。巨菌草根際土微生物群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)微生物的種類，還有待通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)、PLFA 等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)Biolog-ECO 技術(shù)分析巨菌草根際土壤微生物群落代謝功能多樣性，結(jié)果表明，巨菌草根際土壤微生物群落具有較高的AWCD 值，巨菌草根際土壤微生物群落的碳源代謝能力大于非根際土壤。巨菌草根際土壤微生物群落的代謝功能強(qiáng)于非根際土壤。L-蘇氨酸、2-羥基苯甲酸、α-丁酮酸、D-蘋果酸、α-D-乳糖、1-磷酸葡萄糖等碳源巨菌草根際土壤微生物群落不能利用。應(yīng)用培養(yǎng)基培養(yǎng)法研究土壤微生群落時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮不能利用的其他碳源。巨菌草根際土壤微生物的活性及多樣性均比非根際土壤高，該研究結(jié)果為巨菌草的合理種植、生態(tài)治理與土壤改良及提高產(chǎn)量的研究提供理論依據(jù)。