巨尾桉EuDQD/SDH5 基因的克隆與表達分析

王 梅，趙艷玲

（華僑大學化工學院，福建 廈門 361021）

【研究意義】莽草酸脫氫酶（Shikimate dehydrogenase,SDH）催化3-脫氫莽草酸（3-DHS）加氫合成莽草酸（SA）或脫氫形成沒食子酸（GA）［1］。脫氫奎尼酸脫水酶（Dehydroquinate dehydratase,DQD）負責催化3-脫氫奎尼酸向3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)化的可逆反應。植物莽草酸途徑中的SDH 與DQD 形成二聚體復合酶DQD/SDH［2］，這些次生代謝物是木質(zhì)素、凝聚型丹寧、原花青素類等物質(zhì)的合成前體［3］。桉樹是重要的紙漿材樹種，水解單寧占桉木多酚類化合物的5.98%，而縮合單寧占1.91%［4］，單寧在酸、堿、酶條件下都不易水解，工業(yè)造紙上利用濃硫酸將縮合單寧縮合成不溶于水的分子［5］。開展桉樹木材多酚類的分子調(diào)控機理研究，對培育低多酚的紙漿林品種、降低造紙污染具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】SDH 家族具有高度保守的α/β 折疊三維結(jié)構(gòu)，因活性位點殘基和幾何結(jié)構(gòu)的輕微不同而具有不同的底物特異性［6］。在植物中，SDH 通過N 端與DQD 結(jié)合，形成DQD/SDH 復合酶。植物中SDH基因的沉默會影響植物莖高生長以及造成芳香族氨基酸缺乏等現(xiàn)象［7］。目前已經(jīng)分離得到白楊［8］、擬南芥［9］、番茄［10］、煙草［7,11］、葡萄［12］、山茶［13］、赤桉［14］、石榴［15］等植物中的DQD/SDH基因。不同植物因生理特性不同具有不同的DQD/SDH基因種類，目前已發(fā)現(xiàn)擬南芥編碼1 個DQD/SDH基因［8］，白楊編碼5 類DQD/SDH基因［8］，葡萄、赤桉、石榴、山茶等編碼4 類DQD/SDH基因。【本研究切入點】桉樹的多酚類物質(zhì)含量較高，推測桉樹SDH基因家族更加復雜，目前已發(fā)現(xiàn)4 個桉樹SDH家族基因，但與木質(zhì)素合成相關(guān)的桉樹SDH研究較少。本研究根據(jù)桉樹基因組數(shù)據(jù)分離桉樹DQD/SDH基因，通過分析木質(zhì)素含量不同的轉(zhuǎn)基因桉樹植株的DQD/SDH基因表達量，探究DQD/SDH酶與木質(zhì)素合成的相關(guān)性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析巨尾桉SDH 家族EuDQD/SDH5 的酶動力學和表達特性，探究EuDQD/SDH5 與木質(zhì)素生物合成的關(guān)聯(lián)性，為進一步解析巨尾桉多酚類物質(zhì)的合成途徑提供基礎研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生巨尾桉組培苗［16］、轉(zhuǎn)基因盆栽苗（過表達CuZnSOD 的P40、P41［18］，過表達CuZnSOD+反義4CL1基因的F52、F71、F76［19］）、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21均為華僑大學生物技術(shù)實驗室保存。pMD-18T Vector、PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、Takara miniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、Takra MiniBEST Plant RNA Extraction Kit、One Step SYBR?PrimeScripTMPLUS RTPCR Kit，以及TaqPlus DNA polymerase、Bam?、Hind Ⅲ、DNA ligase 等均購自大連寶生物公司，Poly（A）mRNA 純化試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，His-tag Protein purification Kit購自常州天地人和生物科技有限公司。其他常規(guī)試劑購自廈門綠茵試劑玻儀有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因克隆 提取巨尾桉葉片總RNA，具體操作方法參照文獻［17］。依據(jù)巨桉預測的DQD/SDH基因（GenBank 登錄號：XM_010026815.1）設計引物克隆巨尾桉DQD/SDH基因，引物為DQD/SDH5F：5'ATGACTCTCA GCAG CATCCC 3'，DQD/SDH 5R：5'-TCAACTGTTCTTCACCAATG 3'。獲得的目的片段與pMD18-T Vector 連接，PCR 篩選陽性克隆子。

1.2.2 生物信息學分析 委托華大基因公司測序克隆序列，在GenBank 數(shù)據(jù)庫注冊基因序列。通過ExPASy（http://www.expasy.org/）預測DQD/SDH 蛋白質(zhì)的生物化學性質(zhì)和功能特征，Swissmodel（http://swissmodel.expasy.org/）預測DQD/SDH蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/ Tools/InterProScan/）預測DQD/SDH 蛋白質(zhì)家族和功能結(jié)構(gòu)域，利用軟件MEGA5.2 構(gòu)建鄰接樹。

1.2.3 原核表達載體構(gòu)建與酶活性測定設計引物EuDQD/SDH5F：5'GGATCCATGACTC TCAGCAGCATCCC 3'，EuDQD/SDH5R：5'AAGCTTTCAACTGTTCTTCACCAATG 3'，亞克隆獲得具有BamH ?和Hind Ⅲ酶切位點的陽性PCR克隆質(zhì)粒，用BamH ?和Hind Ⅲ雙酶切原核表達載體pET-32a和亞克隆載體，連接目的片段篩選獲得pET-EuDQD/SDH5，按照文獻［7］［11］的方法，通過SDS-PAGE電泳檢測IPTG誘導的融合蛋白的表達。收集誘導蛋白表達的菌液，加入4 mL裂解液，懸浮菌體并放置冰中1 h，通過超聲波震碎機充分裂解樣品，取上清。通過Ni-NTA beads 6FF親和純化His6標記的重組蛋白，用250 mmol/L咪唑（pH 8）洗脫His6標記的重組蛋白，利用Bradford法測定蛋白含量。以莽草酸為底物、NADP+為輔因子，在pH 7條件下，分析波長340 nm處NADHP在酶反應5 min內(nèi)的吸光度變化，采用軟件OriginPro 8.5中Michaelis-Menten線性擬合計算最大速率Vmax和米氏常數(shù)Km，Kcat/Km評估酶在植物體內(nèi)的催化效率。

1.2.4 實時定量PCR 利用實時定量PCR（qRT-PCR）檢測野生巨尾桉組培苗的3 個植物組織（根、莖、葉）、野生巨尾桉盆栽苗不同節(jié)間（第一節(jié)、中間節(jié)、最低節(jié)）的葉片，以及本實驗室轉(zhuǎn)化篩選獲得木質(zhì)素含量降低和不變的巨尾桉轉(zhuǎn)基因植株［18-19］的EuDQD/SDH5表達模式。參照Takara MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 提取總RNA。以巨尾桉18S rRNA 為內(nèi)參基因，使用One Step SYBR?PrimeScripTMPLUS RT-PCR Kit 對目的基因及內(nèi)參基因進行擴增，Eg18S3：5'CATGGCCGTTCTTAGTTGGT 3'，Eg18S4：5'TAGCA GGCTGAGGTCTCGTT 3'，EuDQD/SDH5（1）:5'CCCAATAGCCAAGGCCATAG 3'，EuDQD/SDH5（2）:5'GCT CCATTTGA AGCTCGGAC 3'，反應程序參照文獻［17］，重復測定3 次，按照相對定量法計算EuDQD/SDH5基因表達量：

式中，Ctts為實驗組目的基因Ct 值，Ctns為實驗組內(nèi)參基因Ct 值；Cttc為對照組目的基因Ct 值，Ctnc為對照組內(nèi)參基因Ct 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨尾桉EuDQD/SDH5 基因克隆

提取巨尾桉葉片總RNA 并純化獲得mRNA，通過RT-PCR 擴增獲得巨尾桉EuDQD/SDH基因如圖1 所示，用凝膠回收1 500 bp 處的DNA 片段并與pMD-18T 連接，PCR 篩選陽性克隆子，結(jié)果如圖2 所示，選擇第4、6、9、10 號菌株委托華大基因公司測序，第 6、9、10 號菌株的測序結(jié)果和巨桉基因組數(shù)據(jù)庫的預測基因（GenBank 登錄號：XM_010026815.1）具有同源性，相似性分別為98.75%、98.94%和98.94%。

圖1 RT-PCR 擴增巨尾桉EuDQD/SDH 基因電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of RT-PCR amplification of EuDQD/SDH gene from Eucalyptus grandis × E.urophylla

圖2 pMD-EuDQD/SDH5 質(zhì)粒PCR 驗證電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic result of plasmids PCR verification of pMD-EuDQD/SDH5

2.2 巨尾桉EuDQD/SDH5 的生物信息學分析

由1 對引物克隆得到3 條同源性極高的同源序列，全長均為1 599 bp，編碼532 個氨基酸，分別命名為EuDQD/SDH5-6（GenBank 登錄號：KY401151.1）、EuDQD/SDH5-9（GenBank 登錄號：KY401150.1）、EuDQD/SDH5-10（GenBank登錄號：KY401149.1），其中EuDQD/SDH5-6 與EuDQD/SDH5-10存在7 bp 差異，EuDQD/SDH5-6與EuDQD/SDH5-9存在8 bp 差異，EuDQD/SDH5-9與EuDQD/SDH5-10存在9 bp 差異；3 個基因編碼的蛋白分子質(zhì)量分別為57.24、57.3、57.41 ku，等電點分別為6.83、6.42、6.40。通過在線IterPro預測基因編碼蛋白功能，3 個蛋白均具有脫氫奎尼酸脫水酶和NADP+為輔因子的莽草酸脫氫酶功能，包含4 類保守序列：醛縮酶類? 超家族、莽草酸脫氫酶超家族、NADB Rossmann〔Rossmannfold NAD（P）+binding protein〕超家族和DHQD（Dehydroquinate dehydratase）第一類酶。利用Swiss-model 同源建模蛋白三級結(jié)構(gòu)表明，3 種蛋白在結(jié)構(gòu)上屬于雙功能DQD/SDH，其中SDH 酶通量高于DQD 酶通量。這3 個蛋白除了在二聚體結(jié)合位點稍有不同，其中DQD/SDH5-6 由原來的187Glu 替換成186Phe，在輔因子結(jié)合位點、底物結(jié)合位點的氨基酸殘基則完全相同。

利用MEGA5.2 對擬南芥、白楊、葡萄、巨桉等的DQD/SDH 基因建鄰接樹，結(jié)果（圖3）表明EuDQD/SDH5-6（簡稱EU5-6）、EuDQD/SDH5-9（簡稱EU5-9）、EuDQD/SDH5-10（簡稱EU5-10）與VvSDH4、EgSDH2基因序列相似性為77%，預測EuDQD/SDH5可能具有典型的DQD/SDH 活性，催化3-DHQ 到3-DHS 的脫水反應以及3-DHS 到SA 的氧化還原反應。

圖3 植物DQD/SDH 鄰接樹Fig.3 Neighbor-joining tree of plant DQD/SDH5

2.3 原核表達載體PET-EuDQD/SDH5 的構(gòu)建與表達

BamH?/Hind Ⅲ雙酶切包含EuDQD/SDH5-6、EuDQD/SDH5-9、EuDQD/SDH5-10的DNA 序列和原核表達載體PET32a，構(gòu)建重組載體PETEuDQD/SDH5-6，PET-EuDQD/SDH5-9，PETEuDQD/SDH5-10，雙酶切重組載體質(zhì)粒的電泳結(jié)果（圖4）表明，在1 500 bp 處有目的基因條帶，委托華大基因測序驗證，結(jié)果表明載體構(gòu)建成功。

圖4 重組載體PET-EuDQD/SDH5 的BamH?/HindⅢ雙酶切電泳結(jié)果Fig.4 Double enzyme digestion of recombinant vector PET-EuDQD/SDH5 by BamH?/Hind Ⅲ

參照文獻［8］［12］進行ITPG 誘導重組蛋白表達。3 個EuDQD/SDH5基因的開放閱讀框為1 599 bp，編碼532 個氨基酸，表達57 ku 左右的蛋白，另加表達載體的融合蛋白，預計蛋白條帶在60～70 ku 附近，如圖5 所示，與對照組相比，在70 ku 附近有明顯的蛋白條帶，說明目的蛋白在大腸桿菌中有表達。

圖5 重組蛋白原核表達的SDS-PAGE 電泳結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE electrophoretic results of prokaryotic expression of recombinant protein

2.4 重組蛋白EuDQD/SDH5 酶動力學參數(shù)的測定

用250 mmol/L 咪唑（pH 8）洗脫His6 標記的重組蛋白，測定輔因子為NADP+、底物為莽草酸（SA）的酶催化反應，從表1 可見，EuDQD/SDH5-9 和EuDQD/SDH5-10 對底物SA 的親和力較大，且在植物體內(nèi)的催化效率較高，但EuDQD/SDH5-6 對底物SA 在植物體內(nèi)的催化效率較低，這可能與其二聚體結(jié)合位點的一個氨基酸位置變化有關(guān)，由原來的187Glu 替換成186Phe。

表1 EuDQD/SDH5 酶動力學參數(shù)（輔因子NADP+、底物SA）Table 1 Kinetic properties of EuDQD/SDH5（co-factor NADP+,substrate SA）

2.5 EuDQD/SDH5 在巨尾桉的表達模式

EuDQD/SDH5的3 個基因存在7～9 bp 的差異序列，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)在EuDQD/SDH5特異性最強的200 bp DNA 片段中，3 個基因的序列完全相同，因此熒光定量PCR 所檢測的EuDQD/SDH5的特異性片段表達量是3 個基因的總表達量。采用2-??Ct相對定量法以18S 為內(nèi)參基因，熒光定量PCR 技術(shù)檢測EuDQD/SDH5基因在巨尾桉組培苗不同組織中（根、莖、葉片）的表達模式。EuDQD/SDH5在葉片中表達量最高，莖中表達量稍低，根系表達量最低，葉片表達量約是根部表達量的9 倍。在不同節(jié)間葉片中的表達量也有差異（表2），EuDQD/SDH5在上層幼葉中表達量最高，在中間節(jié)間和下層葉片中表達量都低，EuDQD/SDH5在上層幼葉中的表達量是其他節(jié)間葉片表達量的7 倍左右。

表2 EuDQD/SDH5 基因在巨尾桉中的表達定量分析Table 2 Quantitative analysis of expression of EuDQD/SDH5 gene in Eucalyptus grandis × E.urophylla

EuDQD/SDH5基因?qū)儆诿Р菟崦摎涿讣易宓牡? 類，屬于同一分類的白楊DQD/SDH2（poptr5）主要在木質(zhì)化組織中表達，可能與木質(zhì)素的合成相關(guān)［8］。利用本實驗室轉(zhuǎn)化獲得的硫酸木質(zhì)素含量改變的轉(zhuǎn)基因巨尾桉溫室苗植株（過表達CuZnSOD 的P40、P41［18］，過表達CuZnSOD+反義4CL1基因的F52、F71、F76［19］），研究EuDQD/SDH5基因在葉片中的表達量變化，以野生型巨尾桉葉片EuDQD/SDH5基因的表達量為對照。其中P40 和F52 的硫酸木質(zhì)素含量分別比對照增加2%和減少1.07%，P41、F71 和F76 的硫酸木質(zhì)素含量分別比對照減少55.48%、41.81%、38.68%。從圖6 可見，5 株轉(zhuǎn)基因植株葉片的EuDQD/SDH5基因表達量均低于野生株系，其中轉(zhuǎn)基因植株P(guān)41、F71 和F76 的EuDQD/SDH5基因表達量均降低，暗示EuDQD/SDH5的低表達可能與木質(zhì)素的生物合成有關(guān)，但是轉(zhuǎn)基因株系F52 中該基因表達量也降低，木質(zhì)素含量減少較小，說明莽草酸脫氫酶家族有多個酶為木質(zhì)素生物合成提供前體物質(zhì)。

圖6 巨尾桉轉(zhuǎn)基因植株葉片的EuDQD/SDH5 基因表達分析Fig.6 Quantitative analysis of expression of EuDQD/SDH5 gene in leaves of transgenic Eucalyptus grandis × E.urophylla

3 討論

Bontpart 等［12］將雙子葉植物的DQD/SDH 分成5 類，第4 類是VvSDH4和poptr5，序列相似性為77%。本研究克隆巨尾桉的3 個基因同屬于第4 類，都具有典型的SDH 活性，但對底物莽草酸的親和力不同，其中EuDQD/SDH5-10 對莽草酸的親和力和催化效率均最高。根據(jù)生物信息學分析數(shù)據(jù)，3 個蛋白在輔因子結(jié)合位點、底物結(jié)合位點的氨基酸殘基完全相同，只有在二聚體結(jié)合位點稍有不同，EuDQD/SDH5-6 由原來的187Glu 替換成186Phe，這可能導致EuDQD/SDH5-6 在植物體內(nèi)的催化效率比EuDQD/SDH5-10 和EuDQD/SDH5-9 低。

巨尾按EuDQD/SDH5在幼葉和莖中的表達量較高，暗示EuDQD/SDH5 在莽草酸合成途徑中主要承擔生長發(fā)育旺盛器官的芳香族氨基酸合成以及酚酸類物質(zhì)合成等。屬于同一分類的白楊的DQD/SDH2（poptr5）主要在木質(zhì)化組織中表達，可能與木質(zhì)素的合成相關(guān)［8］。葡萄VvSDH4在葡萄生長發(fā)育期間表達相對穩(wěn)定，在葡萄漿果開始著色成熟期之前表達量最高［12］。這些研究結(jié)果與本研究中EuDQD/SDH5在巨尾桉中表達量的研究結(jié)果相契合。本研究3 個基因在木質(zhì)素含量低的轉(zhuǎn)基因巨尾桉中的表達量也較低，說明該基因的表達與木質(zhì)素的合成有一定關(guān)聯(lián)性，但木質(zhì)素的生物合成途徑復雜［20］，轉(zhuǎn)基因F52 植株的木質(zhì)素含量僅降低約1.07%，而EuDQD/SDH5基因表達量降低約63%，這暗示有多個莽草酸脫氫酶為木質(zhì)素的生物合成提供酚類化合物。

本研究分離的巨尾桉EuDQD/SDH5基因與赤桉EuDQD/SDH2基因相似性為98.81%，赤桉的EcDQD/SDH2 和EcDQD/SDH3 兩種酶均可催化依賴NADP+的3-脫氫莽草酸氧化生成沒食子酸［14］，沒食子酸為水解單寧提供酚酸，是赤桉鋁離子耐受性高的原因之一。有關(guān)莽草酸脫氫酶家族的研究尚處于起步階段，繼續(xù)開展DQD/SDH5 催化3-脫氫莽草酸生成沒食子酸酶動力學研究，通過該基因在桉樹中過量表達或者阻斷表達進一步研究該基因的生物學功能，為桉樹莽草酸脫氫酶家族的研究提供基礎研究數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本研究分離得到巨尾桉3 個EuDQD/SDH5基因，全長均為1 599 bp，EuDQD/SDH5-6與EuDQD/SDH5-10存在7 bp 差異，EuDQD/SDH5-6與EuDQD/SDH5-9存 在8 bp 差 異，EuDQD/SDH5-9與EuDQD/SDH5-10存 在9 bp差異，EuDQD/SDH5-6 由原來的187Glu 替換成186Phe，但是輔因子結(jié)合位點、底物結(jié)合位點的氨基酸殘基則完全相同。3 個EuDQD/SDH5基因的表達蛋白均具有酶活性，EuDQD/SDH5-10對莽草酸的親和力和催化效率都最高。巨尾桉EuDQD/SDH5基因在幼葉和莖中表達水平高，推測可能與木質(zhì)素的合成相關(guān)。