石蒜屬植物無性繁殖技術的應用研究

趙秀娟，張華通，林秀靈，麥任娣，張煜林

（廣東生態(tài)工程職業(yè)學院，廣東 廣州 510520）

【研究意義】石蒜（Lycoris radiataHerb）又稱老鴉蒜、龍爪花、山烏毒、蒜頭草等，為石蒜科石蒜屬多年生鱗莖草本植物，因鱗莖外形似蒜頭而被稱為石蒜。主要分布于東亞的暖溫帶至亞熱帶，我國主要分布于長江以南地區(qū)［1］，其中江蘇、浙江、安徽等種類最多［1］。全世界范圍內石蒜屬植物大約有20 余種，我國約有17 種。石蒜屬植物集觀賞、藥用［2-3］、工業(yè)價值［2］于一體，其觀賞價值主要來源于花朵，具有“中國郁金香”美稱，其花形奇特、花色豐富，有紅色、粉色、黃色、白色、紫色等多種顏色，其葉片也十分美觀，是一種很好的鮮切花和觀賞植物，可用作盆花、地被植物［4-6］。石蒜也是一種藥用植物［2-7］，其鱗莖中富含多種生物堿化合物，由于生物堿毒性較大，可用于生產(chǎn)植物源殺菌劑，用來防治農(nóng)作物病蟲害［8］。我國民間一直把石蒜屬植物作為中藥，一般將其鱗莖搗碎外用，可消腫除毒。此外，可以治療食物中毒、重癥肌無力、淋巴結核、風濕性關節(jié)炎［9］等。石蒜屬植物的鱗莖中富含淀粉和糖膠，如忽地笑（Lycoris autea）鱗莖中含淀粉60%左右、糖膠9%左右［2］，其作為一種新型淀粉植物資源，符合國家提出的燃料乙醇生產(chǎn)原料要求，可作為非糧食原料或輔助生產(chǎn)原料用于生產(chǎn)酒精［10］。目前，石蒜屬植物已成為世界著名球根花卉，國內外已有大量栽培與商品切花生產(chǎn)，在觀賞花卉及切花方面頗具開發(fā)前景，可出口到荷蘭和日本等地，為國家出口創(chuàng)匯［11］。

【前人研究進展】我國人工栽培石蒜歷史短，作為大力發(fā)展的球根花卉，須改自然野生為規(guī)?；蟹N植，實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)石蒜切花等供應國內外市場。石蒜屬植物是極具市場潛力的花卉和藥用植物資源，其種子常規(guī)播種繁殖成活率低，主要以無性繁殖為主［12-13］。目前有分球、鱗塊基底切割和組織培養(yǎng)等無性繁殖方法［12-31］，且?guī)追N繁殖方法的比較研究尚未有報道。通常以分球法為主，而其自然分球繁殖系數(shù)低［16-17］，多數(shù)品種每年僅能分生1～2 個子球，如忽地笑的自然分球繁殖率僅1.8 倍，極難在短期內實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)石蒜切花、盆花或作為地被植物造景。

【本研究切入點】解決優(yōu)良石蒜種源［32］繁殖問題，尤其種球的增殖技術是該類植物產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用的關鍵。【擬解決的關鍵問題】石蒜屬植物是極具市場潛力的花卉和藥用植物，無性繁殖方法有分球、鱗塊基底切割和組織培養(yǎng)等方法，通常以分球法為主，但其自然分球繁殖系數(shù)低。本研究通過種子實生無菌苗離體培養(yǎng)、鱗片離體培養(yǎng)、鱗塊基底切割繁殖、切去鱗莖1/3 后的鱗塊基底切割繁殖等無性繁殖技術，解決種源繁殖問題尤其是種球的增殖，彌補石蒜種子播種繁殖成活率低、常規(guī)分球繁殖系數(shù)低的不足，為石蒜種源快繁體系建立和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用而提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為5 年生的忽地笑（Lycoris aurea）、紅花石蒜（Lycoris radiate）、長筒石蒜（Lycoris longituba）、換錦花（Lycoris sprengeri）等品種（品系）鱗莖，及采自該4 個品種的新鮮種子。鱗片離體培養(yǎng)、鱗塊基底切割繁殖、切去鱗莖1/3 后的鱗塊基底切割繁殖試驗，主要選用觀賞和藥用價值都較高的石蒜品種2～3 種。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子實生無菌苗離體培養(yǎng) 取忽地笑（黃花）、紅花石蒜（紅花）、換錦花（粉紅花）、長筒石蒜（白花）4 個品種的新鮮種子，于超凈工作臺用75%酒精浸泡60 s，用0.1% HgCl 溶液滅菌10 min，用無菌水沖洗2 次，再用0.1%HgCl 溶液滅菌5 min，無菌水沖洗4 次。分別接種于無菌苗誘導培養(yǎng)基1/2 MS+蔗糖15 g/L 上。每瓶培養(yǎng)基接種1粒種子，1個月后統(tǒng)計發(fā)芽情況，并待苗長2 cm 以上時作為外植體，發(fā)芽率（%）=發(fā)芽瓶數(shù)/未污染瓶數(shù)×100。培養(yǎng)條件為溫度25（±2）℃、光照時間8 h/d、光照強度2 000～3 000 lx、pH 值5.6～5.8。用無菌苗作外植體進行發(fā)芽誘導培養(yǎng)基、叢生芽誘導培養(yǎng)基、增殖壯芽培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基等篩選，培養(yǎng)條件同上。進入生根階段時，把單個鱗莖接種到生根培養(yǎng)基后，第2 天直接將培養(yǎng)瓶苗放在溫室大棚中同步進行生根及煉苗，再把煉苗后的生根苗移栽在溫室大棚中進行栽培管理，移栽基質采用泥炭土、蛭石、河沙等不同配比，試管苗移栽量100 株，3 次重復。

1.2.2 鱗片離體培養(yǎng) 新鮮石蒜鱗莖用清水沖洗后，去外鱗片、球頂部分的葉片，于超凈工作臺用75%酒精浸泡30 s，再用0.1% HgCl 溶液浸泡15 min，無菌水沖洗5～6 次。將鱗莖上半部切除，再“十”字形分割成4 等份，或“米”字形分割成6 等份，每等份含2～8 片鱗片且有鱗片基部的基盤，接種于不同生長調節(jié)物質配比MS 培養(yǎng)基中，進行初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基等篩選。培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 鱗塊基底切割繁殖 鱗塊基底采用二分法（分為帶基盤鱗片2 塊）、四分法（分為帶基盤鱗片4 塊）進行切割。先稍沖洗石蒜鱗莖，去除腐爛或干枯的外鱗片、球頂部分的葉片并晾干，刀消毒后切割鱗莖，切口稍晾干半天，切口再沾取草木灰，埋入消毒和未消毒基質（或沙）中，溫度設定23～27℃、28～35℃等2 個處理，經(jīng)常檢查及保持基質（或沙）濕度在60%～70%左右。

1.2.4 切去鱗莖1/3 后的鱗塊基底切割繁殖 鱗莖頂部橫切掉1/3 后，進行二分法（同上）、四分法（同上），切下的鱗莖頂部可作為藥用部分的來源。切口處理同上，埋入消毒后基質（或沙）中，在溫度25（±2）℃、基質（或沙）濕度60%～70%條件下進行繁殖。

2 結果與分析

2.1 石蒜種子實生無菌苗離體培養(yǎng)

2.1.1 石蒜種子無菌苗培養(yǎng)結果 從表1 可以看出，在污染率方面，長筒石蒜顯著低于其余3 種，僅紅花石蒜稍高。但紅花石蒜發(fā)芽率最高，其次是忽地笑。紅花石蒜、忽地笑是適合廣東栽培的優(yōu)良切花、藥用石蒜品種，其種子無菌苗高發(fā)芽率為組織培養(yǎng)奠定了基礎。

表1 石蒜種子無菌苗培養(yǎng)結果Table 1 Culture results of sterile seedlings of Lycoris radiata seeds

2.1.2 石蒜種子無菌苗離體培養(yǎng)結果 從表2可以看出，篩選出適合石蒜叢生芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 5 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L、增殖壯芽培養(yǎng)基為MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+活性炭1 g/L、生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖15 g/L。忽地笑、紅花石蒜的叢生芽誘導率、增殖倍數(shù)、生根率均高于換錦花、長筒石蒜。此離體快繁技術為優(yōu)良石蒜產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用解決了種源繁殖問題。

表2 石蒜種子無菌苗離體培養(yǎng)結果Table 2 In vitro culture results of sterile seedlings of Lycoris radiata seeds

2.1.3 試管苗移植 從表3 可以看出，試管苗移栽于不同基質中，成活率最高的基質為河沙，但綜合根和苗生長情況則以泥炭土∶蛭石∶河沙（7∶2∶1）較好。

表3 石蒜試管苗移栽結果Table 3 Transplanting results of test-tube seedlings of Lycoris radiata

2.2 石蒜鱗片離體培養(yǎng)

2.2.1 不同培養(yǎng)基誘導石蒜小鱗莖 試驗摸索出生長調節(jié)物質的不同濃度組合（表4），對3種石蒜小鱗莖的誘導有較大差異，紅花石蒜在MS +6-BA 3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖 30 g/L培養(yǎng)基中誘導率最高，忽地笑和長筒石蒜在MS +6-BA 5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖 50 g/L 培養(yǎng)基中誘導率最高。

表4 石蒜鱗片離體培養(yǎng)結果Table 4 Results of buld scale culture in vitro of Lycoris radiata

鱗片接入誘導培養(yǎng)基3～5 d 后膨脹并向內側卷曲，繼而開始張開，紅花石蒜培養(yǎng)3～4 周后鱗片間陸續(xù)可見有米粒狀突起，逐漸長大成小鱗莖。忽地笑和長筒石蒜出現(xiàn)突起的時間比紅花石蒜推遲10 d 左右。鱗莖以“十”字形或“米”字形分割，誘導情況無顯著差異。

2.2.2 小鱗莖生根培養(yǎng) 未長根的小鱗莖轉接到生根培養(yǎng)基MS+NAA 1.0 mg/L+30 g/L 蔗糖+瓊脂6 g/L，2～4 周后均可見小鱗莖基部發(fā)出多條白色根，生根率達91.7 %以上。

2.3 石蒜鱗塊基底切割繁殖

2.3.1 鱗塊基底切割繁殖適宜時期 從表5 可以看出，忽地笑、紅花石蒜、換錦花最適宜時期是花后葉片生長初期，大約為9-10 月份。

表5 石蒜鱗塊基底切割不同繁殖時期成活率Table 5 Survival rate of different propagation periods of bulbs base cutting of Lycoris radiata

2.3.2 鱗塊基底切割的鱗片處理結果 研究結果表明，忽地笑、紅花石蒜的切割鱗片在25（±2）℃左右、60%～70%濕度下有利于生長，死亡率降至10%以下。切割鱗片于消毒過的基質（沙）中進行繁殖培養(yǎng)，其死亡率降至10%～12.5%（表6）。

表6 石蒜鱗塊基底切割的鱗片處理結果Table 6 Results of treatments of bud scale after bulbs base cutting of Lycoris radiata

2.3.3 鱗塊基底切割繁殖結果 帶基盤鱗片于基部斷口處會分化出分生組織，然后形成小鱗莖。在溫濕適宜條件下，10～15 d開始逐漸形成小鱗莖。小鱗莖形成方式大致可分為3 種生長類型:（1）先形成小鱗莖，小鱗莖膨大到一定程度后，在基部長出基根；（2）小鱗莖與基根幾乎同時生長發(fā)育，在萌發(fā)小鱗莖時，基部也生長出基根；（3）在鱗片基部先長根，暫時不形成小鱗莖，該類型出現(xiàn)機會很少，多發(fā)生在薄而小的鱗片中［6］。研究發(fā)現(xiàn)，不同生長情況都可生成數(shù)目不等的子球（小鱗莖），且所生子球都位于鱗片內側傷口處。

60～70 d 后，大多數(shù)帶基盤鱗片的內側底端生根并形成小鱗莖，且鱗莖上長出葉片，成苗率均高于90%。忽地笑、紅花石蒜采用二分法，其形成子球數(shù)、生根率、成苗率均高于四分法（表7）。

表7 石蒜鱗塊基底切割繁殖結果Table 7 Propagation results of bulbs base cutting of Lycoris radiata

2.4 切去鱗莖1/3 后的鱗塊基底切割繁殖結果

鱗莖頂部橫切掉種球1/3 后的二分法、四分法，帶基盤鱗片在基部斷口處于20～25 d 后開始漸漸形成小鱗莖。75～85 d 后，大多數(shù)帶基盤鱗片的內側底端生根并形成小鱗莖，且鱗莖上長出葉片，成苗率均高于86%（表8）。

表8 切去鱗莖1/3 后的石蒜鱗塊基底切割繁殖結果Table 8 Propagation results of scale bulbs base incisions after 1/3 of bulb being removed of Lycoris radiata

同樣，忽地笑、紅花石蒜采用二分法，其形成子球數(shù)、生根率、成苗率均高于四分法。

3 討論

石蒜采用鱗片離體培養(yǎng)，在切割鱗莖時有黏液流出，導致外植體易污染，且大部分由細菌引起，因為鱗莖來自土壤中，表面消毒不能完全殺滅根部雜菌，紅花石蒜表現(xiàn)尤為明顯，這與前人報道相同［26］。鱗片離體培養(yǎng)過程中出現(xiàn)褐化死亡現(xiàn)象，與一些球根花卉組織培養(yǎng)有類似之處［27-31］。采用種子實生無菌苗離體培養(yǎng)，種子發(fā)芽的污染率較高，但利用無菌苗作為外植體，可避免組培的污染、褐化死亡現(xiàn)象，繁殖效率大幅提升，比前人研究有所改進。

采用鱗片離體培養(yǎng)，在初代、繼代培養(yǎng)過程中，均不形成愈傷組織，直接形成不定芽，然后漸形成小鱗莖。與種子實生無菌苗離體培養(yǎng)相比，時間短、簡便、高效，但存在一定的污染率。

不同培養(yǎng)基誘導石蒜小鱗莖膨大過程中，碳源是重要因素之一，蔗糖對小鱗莖膨大也有一定影響［26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)，忽地笑于高濃度蔗糖培養(yǎng)基上，生長旺盛、葉片濃綠、粗壯，鱗莖迅速膨大，這與前人報道較一致。

小鱗莖生根培養(yǎng)過程中，隨時間延長（30 d以上），有些根系會逐漸老化并變黑褐色。但紅花石蒜小鱗莖在繼代過程中隨時間延長（110 d 以上），仍有根發(fā)生，此現(xiàn)象還需進一步研究。

試管苗移栽于泥炭土∶蛭石∶河沙（7∶2∶1）較好，因泥炭土能提供一些養(yǎng)分，蛭石+河沙則比河沙好，主要體現(xiàn)在保水性和通氣性方面［16］。

鱗塊基底切割繁殖，鱗片切口經(jīng)草木灰處理，其形成子球數(shù)（小鱗莖）、生根率、成苗率均高于未處理的對照，可能是草木灰有消毒切口、吸干切口黏液、提高鱗片抗性、減少腐爛等作用。忽地笑、紅花石蒜鱗片在25（±2）℃左右、60%～70%濕度下，有利于生長，大幅降低死亡率，有利于產(chǎn)業(yè)化推廣應用。

石蒜利用鱗塊基底切割繁殖，二分法的繁殖系數(shù)提高1 倍，子球至開花需3～4 年；四分法形成的子球也較大，繁殖倍數(shù)接近二分法，但子球至開花需4～5 年，比二分法長1～2 年。從產(chǎn)業(yè)化利用效益來說，二分法鱗塊基底切割繁殖是石蒜屬植物無性繁殖行之有效的方法，值得推廣。

比較鱗塊基底切割繁殖、切去鱗莖1/3 后鱗塊基底切割繁殖，一是其形成子球數(shù)、生根率、成苗率均差異不明顯，前者成苗率高于90%，后者高于86%；二是后者相對前者，在開始形成小鱗莖方面要遲10 d 左右，帶基盤鱗片的內側底端生根和成苗的時間要遲15 d 左右，在產(chǎn)業(yè)化推廣應用上差異不顯著；三是運用切去鱗莖1/3 后的鱗塊基底切割繁殖，切下的部分可作為藥用部分，為石蒜作為藥用花卉產(chǎn)業(yè)化開發(fā)與利用提供了來源保障，比前者及種子實生無菌苗離體培養(yǎng)、鱗片離體培養(yǎng)、常規(guī)分球繁殖等更有推廣價值。

4 結論

上述4 種無性快繁技術研究，彌補了石蒜種子常規(guī)播種繁殖成活率低、常規(guī)分球繁殖系數(shù)低且速度慢的不足，為石蒜種源快繁體系建立和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用提供了技術支撐。

二分法鱗塊基底切割繁殖，是石蒜屬植物一種有效、簡易、低成本的無性快速繁殖方法，切去鱗莖1/3 后的鱗塊基底切割繁殖，是石蒜作為藥用花卉產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的創(chuàng)新性應用，是最有推廣價值的無性繁殖技術。