人工智能氣候室中靈芝富硒栽培研究

張玉華，張北壯，黃仕祥，何煥清，龔玉蓮，曾碧健，蔡文韜，王 璐

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】硒是人體必需的重要微量元素［1］，能夠提高機(jī)體免疫力［2-4］和抗氧化能力［5-8］，預(yù)防腫瘤等有關(guān)疾病發(fā)生［9-11］，在抗衰老及作為部分金屬元素的天然解毒劑等方面有重要生理效果［12-13］。缺硒不僅使人的抵抗力下降，還會(huì)增加疾病的發(fā)生幾率［14-15］。硒主要以無機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)兩種形式存在，不能由機(jī)體自主合成，只能從體外攝取，人體攝入的有機(jī)硒主要是硒蛋白和硒多糖［16］。對硒鹽的毒理分析表明，無機(jī)硒（如硒酸鹽、亞硒酸鹽）的毒性相對較強(qiáng)，機(jī)體吸收率較低；而有機(jī)硒毒副作用較小，生物利用率高，生理藥理功能也相對優(yōu)越［17］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】我國硒資源非常豐富，但均以無機(jī)態(tài)形式存在，使用范圍和劑量受限。通過人工栽培靈芝將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒是研究熱點(diǎn)。有關(guān)研究表明，靈芝具有極強(qiáng)的富集硒功能，其耐硒能力和生物轉(zhuǎn)化率比猴頭菌、香菇、金針菇等食用菌高［18］，富硒靈芝是利用生物轉(zhuǎn)化法研制的一種新的含硒補(bǔ)劑，對人體健康具有重要保健作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前利用靈芝為載體進(jìn)行生物富硒的研究中，大多采用液體發(fā)酵進(jìn)行［19-22］，也有少數(shù)學(xué)者以亞硒酸鹽（亞硒酸鈉）為硒源，采用固體基質(zhì)栽培的方法進(jìn)行［23］。開發(fā)生物源有機(jī)硒是為機(jī)體提供硒源的有效途徑，也是目前人工栽培富硒靈芝研究的熱點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在人工智能氣候室中，以硒礦粉作為硒源進(jìn)行固體栽培靈芝富硒研究，充分利用硒礦資源，通過靈芝體內(nèi)轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，篩選固體基質(zhì)栽培富硒靈芝的條件和較適合的硒濃度，為靈芝商業(yè)化栽培和富硒產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 硒源 供試硒源為硒礦粉，來源于湖北恩施，含硒量為50 μg/g。

1.1.2 培養(yǎng)基配方 供試靈芝（Ganoderma lucidum）菌株由廣州中大圣之禾靈芝產(chǎn)業(yè)科技園篩選培育。母種培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO4?7H2O 1.5 g、維生素B110～20 mg、瓊脂18～20 g、水1 000 mL、自然pH。培養(yǎng)基經(jīng)0.14～0.15 MPa滅菌30 min，冷卻備用。

栽培種培養(yǎng)基配方為木屑73%、麩皮25%、蔗糖1%、石膏1%，將上述培養(yǎng)基質(zhì)充分拌勻后加水，含水量達(dá)60%～65%，pH 6.0～6.5，攪拌均勻后裝袋，在100℃滅菌室中滅菌16～18 h，保溫3 h。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，冷卻至25℃左右即可在超凈工作臺(tái)上按無菌操作規(guī)程接種。

1.2 試驗(yàn)方法

按廣東省食品安全企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/GDSZH 002-2017 方法，采用分光光度計(jì)法測定各試驗(yàn)處理（表1）孢子粉和子實(shí)體的多糖和總?cè)坪?。按國家檢測標(biāo)準(zhǔn)GB5009.93-2010 方法，采用原子熒光光譜法測定各試驗(yàn)處理孢子粉和子實(shí)體的硒含量。

表1 各處理菌包外源性硒礦粉與硒含量Table 1 The exogenous selenium ore powder and selenium content in bacteria packags of different treatments

1.2.1 栽培條件 試驗(yàn)在靈芝人工智能氣候室栽培系統(tǒng)中進(jìn)行［24］，栽培全程采用全熱交換節(jié)能控制系統(tǒng)、恒溫系統(tǒng)、新風(fēng)系統(tǒng)、PM2.5 過濾系統(tǒng)、智能光照系統(tǒng)和超聲波加濕技術(shù)等智能化的工業(yè)控制手段人工模擬自然生長環(huán)境，根據(jù)靈芝生長發(fā)育習(xí)性，在靈芝各生長發(fā)育過程給予所需的光質(zhì)和光照強(qiáng)度、溫濕度、O2、CO2等條件。進(jìn)入人工氣候室用于栽培的水經(jīng)過磁化處理，進(jìn)入培養(yǎng)室的空氣采用PM2.5 過濾系統(tǒng)過濾，為靈芝生長發(fā)育提供最適宜的環(huán)境條件，確保結(jié)果可靠性。

1.2.2 栽培方法 （1）菌絲培育。將已接種的菌包置于25～28℃人工智能氣候室中暗培養(yǎng)30～40 d。當(dāng)菌絲體長滿菌包時(shí)，再將菌包移入人工智能氣候室進(jìn)行出芝培養(yǎng)。

（2）出芝培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度25～28℃，濕度60%～70%；CO2控制在400～600 μl/L；光照為1 000～1 200 lx。菌包出現(xiàn)子實(shí)體原基時(shí)濕度提高到85%～90%，且采用促進(jìn)靈芝子實(shí)體原基分化的紅光光照系統(tǒng)處理［25］，給予光譜波長為600～650 nm 的紅光照射7 d，以促進(jìn)靈芝子實(shí)體形成和孢子產(chǎn)生。子實(shí)體直徑達(dá)到3 cm 時(shí)，濕度提高到90%～95%。子實(shí)體生長至成熟過程的顏色變化為白→淺黃→黃→紅褐色，當(dāng)子實(shí)體的邊緣白色消失（邊緣變紅）時(shí)，表明子實(shí)體已成熟，開始噴射孢子，濕度逐漸降至65%～70%。

（3）采收。靈芝孢子噴粉歷時(shí)28～30 d，完成噴粉后立即采收，并把收集到的孢子粉用低溫洗滌、真空干燥凈化專利技術(shù)［26］進(jìn)行處理，使靈芝孢子粉的試驗(yàn)凈度達(dá)到100%。靈芝子實(shí)體采收后，用清水洗凈切片后在真空干燥室中進(jìn)行干燥處理。靈芝孢子粉和子實(shí)體供試樣本的含水量控制在10%以下。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝孢子粉中硒含量

表2 試驗(yàn)結(jié)果顯示，對照孢子粉的平均單產(chǎn)為9.57 g/菌包，硒含量為0.13 μg/g。處理2 孢子粉的平均單產(chǎn)為9.82 g/菌包，硒含量為1.10 μg/g，與對照相比，硒富集系數(shù)為8.5。處理3 孢子粉的平均單產(chǎn)為9.85 g/菌包，硒含量為3.20 μg/g，硒富集系數(shù)為24.6。處理4 孢子粉的平均單產(chǎn)為10.56 g/菌包，硒含量為4.40 μg/g，硒富集系數(shù)為33.8。處理5 孢子粉的平均單產(chǎn)為9.83 g/菌包，硒含量為6.80 μg/g，硒富集系數(shù)為52.3。處理6 孢子粉的平均單產(chǎn)為9.75 g/菌包，硒含量為7.70 μg/g，硒富集系數(shù)為59.2。單因素方差分析顯示，各處理間靈芝孢子粉硒含量均存在極顯著差異。LSD 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，對照靈芝孢子粉硒含量顯著低于硒礦粉添加處理；處理2 靈芝孢子粉硒含量顯著低于其他處理，在本試驗(yàn)硒濃度范圍，靈芝孢子粉中的硒含量隨菌包中硒礦粉添加量的增加而提高，兩者呈正相關(guān)。

表2 外源性硒礦粉對靈芝孢子粉硒含量的影響比較Table 2 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on selenium content in Ganoderma lucidum spore powder

處理3、4 靈芝孢子粉產(chǎn)量顯著高于對照，處理2、5 與對照和其他處理間不存在顯著差異?？梢?，在本試驗(yàn)硒濃度范圍，菌包中添加硒礦粉不影響孢子粉的形成和產(chǎn)量。

2.2 靈芝孢子粉中多糖和總?cè)坪?/h3>

表3 結(jié)果表明，對照中每100 g 孢子粉中多糖和總?cè)坪颗c各硒礦粉添加處理差異不顯著?？梢?，在本試驗(yàn)硒濃度范圍，菌包中添加硒礦粉不影響孢子粉中多糖和總?cè)频暮铣?，不影響其含量。自然條件下，每100 g 靈芝孢子粉中多糖含量約1.8 g，總?cè)坪考s3.0 g，對照多糖及總?cè)坪坑写蠓忍嵘梢娙斯ぶ悄軞夂蚴覟殪`芝生長發(fā)育提供最適宜的環(huán)境條件，有利于靈芝孢子粉中多糖和總?cè)频暮铣伞?/p>

表3 外源性硒礦粉對靈芝孢子粉多糖和總?cè)坪康挠绊懕容^Table 3 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on polysaccharide and total triterpene contents in Ganoderma lucidum spore powder

2.3 靈芝子實(shí)體中硒含量

由表4 可知，對照子實(shí)體的平均單產(chǎn)為15.83 g/菌包，硒含量為0.35 μg/g。處理2 子實(shí)體的平均單產(chǎn)為14.65 g/菌包，硒含量為1.30 μg/g，與對照相比，硒富集系數(shù)為3.7。處理3 子實(shí)體的平均單產(chǎn)為15.12 g/菌包，硒含量為5.15 μg/g，與對照相比，硒富集系數(shù)為14.7。處理4 子實(shí)體的平均單產(chǎn)為15.05 g/菌包，硒含量為10.90 μg/g，與對照相比，硒富集系數(shù)為31.1。處理5 子實(shí)體的平均單產(chǎn)為14.86 g/菌包，硒含量為16.25 μg/g，與對照相比，硒富集系數(shù)為46.4。處理6 子實(shí)體的平均單產(chǎn)為15.20 g/菌包，硒含量為17.05 μg/g，與對照相比，硒富集系數(shù)為48.7。通過單因素方差分析，各處理靈芝子實(shí)體硒含量間存在極顯著差異。LSD 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，對照的靈芝子實(shí)體硒含量顯著低于其他各處理，硒含量隨菌包中硒礦粉添加量的增加而提高，兩者呈正相關(guān)。

表4 外源性硒礦粉對靈芝子實(shí)體硒含量的影響比較Table 4 Comparison of the effects of exogenous selenium ore powder on selenium content in Ganoderma lucidum fruit body

單因素方差分析結(jié)果表明，對照靈芝子實(shí)體產(chǎn)量顯著高于處理2，各硒礦粉添加處理間不存在顯著差異?？梢?，菌包中添加硒礦粉不影響子實(shí)體的形成和產(chǎn)量。

2.4 靈芝子實(shí)體中多糖和總?cè)坪?/h3>

試驗(yàn)單因素方差分析結(jié)果（表5）表明，對照中每100 g 子實(shí)體中多糖和總?cè)坪颗c其他5個(gè)處理差異不顯著?？梢?，在本試驗(yàn)硒濃度范圍，菌包中添加硒礦粉不影響子實(shí)體中多糖和總?cè)频暮铣?，不影響其含量。自然條件下，每100 g 靈芝子實(shí)體中多糖含量約0.6 g，總?cè)坪考s1.0 g，對照多糖及總?cè)坪坑写蠓嵘?，可見人工智能氣候室為靈芝生長發(fā)育提供最適宜的環(huán)境條件，有利于靈芝子實(shí)體中多糖和總?cè)频暮铣伞?/p>

表5 外源性硒礦粉對靈芝子實(shí)體多糖和總?cè)坪康挠绊懕容^Table 5 Comparison of the effects of exogenous selenium ore ponder on polysaccharide and total triterpene contents in Ganoderma lucidum fruit body

3 討論

硒對人體的重要生理功能越來越為各國重視，許多國家根據(jù)本國自身情況，制定硒營養(yǎng)的推薦攝入量。中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)對我國不同人群的硒推薦用量有所不同，預(yù)防營養(yǎng)缺乏病人群的日攝入量為50 μg，亞健康保健人群的日攝入量為100 μg，預(yù)防癌癥等重大慢性疾病人群的日攝入量為200 μg，治療期間的日攝入量大于200 μg。我國是世界主要硒資源國家之一，已查明的硒蘊(yùn)藏量占全球硒資源量的1/3，湖北恩施和陜西紫陽是我國兩個(gè)高硒區(qū)，硒資源較豐富。然而，我國大多數(shù)地區(qū)屬于“貧硒”地區(qū)，根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)對我國13 個(gè)省市的調(diào)查，目前成年人日平均硒攝入量只有30 μg 左右，與推薦用量的最低限度50 μg相距甚遠(yuǎn)。靈芝是珍貴的藥食兩用真菌,具有較強(qiáng)的耐硒和富硒能力，富硒靈芝比普通靈芝表現(xiàn)出更好的生物效應(yīng)，因此富硒靈芝作為利用生物轉(zhuǎn)化法研制的一種新的含硒補(bǔ)劑對預(yù)防疾病和提高機(jī)體的健康水平具有極其重要的意義［16-17］。本試驗(yàn)以硒礦粉作為硒源添加到靈芝固體基質(zhì)中，起到靈芝生物富硒的作用。本研究表明在靈芝菌包中添加硒5 000 μg，可獲得含硒量為7.7 μg/g的靈芝孢子粉和含硒量為17.05 μg/g 的靈芝子實(shí)體，因此成年人在正常飲食條件下，每天食用3 g孢子粉可達(dá)到預(yù)防硒元素營養(yǎng)缺乏病和日常保健作用。靈芝子實(shí)體雖然含硒量較高，但由于木纖維結(jié)構(gòu)不能直接被食用，要經(jīng)過蒸煮的方法獲得子實(shí)體煮出液，而目前對靈芝子實(shí)體煮出液含硒量的研究尚無報(bào)道。靈芝具有極強(qiáng)的富集硒功能和耐硒能力［18］，在硒濃度很高的基質(zhì)中其生長發(fā)育不會(huì)受到抑制。本試驗(yàn)在固體栽培基質(zhì)的菌包中加入硒源的最高含量為5 000 μg，遠(yuǎn)未達(dá)到抑制靈芝生長發(fā)育的濃度。下一步將提高硒濃度進(jìn)行靈芝富硒試驗(yàn)，以期得到含硒量更高的靈芝子實(shí)體和孢子粉產(chǎn)品。

目前靈芝富硒研究大多采用液體發(fā)酵的方法［19-20］，液體培養(yǎng)的靈芝菌絲體硒含量較高，且與固體基質(zhì)栽培子實(shí)體相比，發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體簡便、快捷、高效，因此采用發(fā)酵工程手段對靈芝進(jìn)行富硒培養(yǎng)被認(rèn)為是一種發(fā)展趨勢，為規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)打下基礎(chǔ)［21-22］。眾多研究者為提高發(fā)酵培養(yǎng)獲得的靈芝菌絲體的產(chǎn)量以及硒含量，在硒源選用、菌種選育及培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面做了很多研究［27］。靈芝中的三萜類成分主要分布在子實(shí)體的外周部分，含量隨子實(shí)體成熟度的提高而遞增［28］。大多數(shù)品種的靈芝在菌絲體生長發(fā)育期間僅形成三萜化合物的前體，而具有生物活性的三萜類化合物隨子實(shí)體的生長發(fā)育才生成。子實(shí)體顯蕾期三萜含量較低，成熟期含量最高［29］，菌絲體及發(fā)酵液中三萜類化合物的數(shù)量和種類均較少［30］。為獲得富硒且富含三萜化合物的靈芝子實(shí)體和孢子粉，采用以硒礦粉作為硒源進(jìn)行固體基質(zhì)栽培靈芝是一種切實(shí)可行的方法。此方法既可充分利用硒礦資源，又可降低生產(chǎn)成本，對靈芝富硒栽培的推廣與應(yīng)用具有積極意義。

4 結(jié)論

本研究以硒礦粉為硒源加入到靈芝固體栽培基質(zhì)中，探討靈芝孢子粉和子實(shí)體富集硒的作用，以及對孢子粉和子實(shí)體產(chǎn)量、多糖和總?cè)坪康挠绊憽? 個(gè)試驗(yàn)處理中，每個(gè)靈芝菌包的加硒量分別為0、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μg，產(chǎn)出孢子粉中硒的富集系數(shù)分別為1、8.5、24.6、33.8、52.3、59.2，產(chǎn)出子實(shí)體中硒的富集系數(shù)分別為1、3.7、14.7、31.1、46.4、48.7。試驗(yàn)結(jié)果表明靈芝孢子粉和子實(shí)體中硒的富集系數(shù)隨菌包中硒的加入量增加而提高，兩者呈正相關(guān)。在6 個(gè)試驗(yàn)處理中，靈芝孢子粉、子實(shí)體的產(chǎn)量以及多糖、總?cè)频暮坎町惒伙@著。研究結(jié)果表明，在本試驗(yàn)的硒濃度范圍內(nèi)靈芝富硒栽培不影響孢子粉、子實(shí)體的形成和產(chǎn)量，孢子粉、子實(shí)體中多糖和總?cè)频暮恳膊皇苡绊憽?/p>