FAK抑制劑對肝癌HCC-LM3細(xì)胞骨架重排和侵襲的作用機(jī)制

姚紅兵，肖 芳，郭 威，吳嘉興，文雪霖，蔣建暉，華赟鵬

（1.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西桂林 541199；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第924醫(yī)院腫瘤科，廣西桂林 541002；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝外科，廣東廣州 510080）

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其病情進(jìn)展迅速，待臨床確診時(shí)大部分已為肝癌晚期。侵襲轉(zhuǎn)移是促進(jìn)其病情進(jìn)展的主要原因之一，也是肝癌治療預(yù)后差的主要因素［1］，因此干預(yù)轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶分子已成為肝癌研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。黏著斑激酶（focaladhesionkinase，F(xiàn)AK）是一種非受體酪氨酸激酶，既往研究表明，F(xiàn)AK可通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲、遷移等過程，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子之一［2］。CT-707 是一種新型的FAK 激酶抑制劑，具有良好的抗肝癌細(xì)胞增殖作用［3］。本課題組前期研究表明，CT-707 在肝癌動物模型中可抑制肝癌細(xì)胞的增殖以及腫瘤形成，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡［4］，但相應(yīng)機(jī)制尚需深入研究。故本研究擬選取人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞HCC-LM3和裸鼠為研究對象，基于FAK/PI3K/Akt通路，進(jìn)一步探討CT-707對肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力以及腫瘤生長的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞及動物 人肝癌細(xì)胞系HCC-LM3由上海生命科學(xué)院細(xì)胞所提供。12只BALB/c裸鼠購自上海林暢生物有限公司，均為6 周齡雌性，于SPF級條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)均通過我院倫理委員會審核、批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM（Hyclone SH30023.01），胎牛血清（Hyclone SH30070.03），青鏈霉素混合液（Solarbio，P1400），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，RR047a），SYBR Green qPCRMix（Monad，MQ10301），TRIzol Reagent（Invitrogen，15596026），BCA 蛋白定量試劑盒（Solarbio PC0020），ECL 化學(xué)發(fā)光底物（超敏）（Biosharp BL523A），Transwell小室（Corning，3422），CT-707（MCE HY-109084），Anti-Palladin antibody（abcam，ab169051），Anti-Vimentin antibody（abcam，ab92547），Anti-MMP2 antibody（abcam，ab97779），Anti-MMP9 antibody（abcam，ab38898），Anti-p-FAK antibody（abcam，ab81298），Anti-FAK antibody（abcam，ab40794），Anti-p-PI3K antibody（CST17366），Anti-PI3K antibody（abcam，ab70912），Anti-p-Akt antibody（CST4060），Anti-Akt antibody（abcam，ab179463），β-actin（abcam，ab8227），MTT（Solarbio，M1020），HE 染色試劑盒（Solarbio G1121）。主要儀器：電泳轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad PowerPac Basic）、多功能酶標(biāo)儀（美國MD FilterMax F3）、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能Tanon 5200）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Agilent Technologies，G8830-64001）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞系HCC-LM3 采用含10 g/L胎牛血清和1%雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素0.1mg/mL）的DMEM，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日傳代，選取生長狀態(tài)量好的細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞融合至60%～70%時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組及給藥 HCC-LM3 分為Control 組、CT-707 低劑量（1.5 μmol/L）組、CT-707 中劑量（3 μmol/L）組、CT-707 高劑量（6 μmol/L）組。細(xì)胞給藥前換入無血清DMEM 去血清同步化24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，加入相應(yīng)劑量的含藥DMEM，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3 Transwell 將Matrigel 膠于4 ℃過夜融化，與無血清培養(yǎng)基以2：1體積比混勻，吸取200 μL混合液鋪于Transwel 小室上室，培養(yǎng)箱放置至基質(zhì)膠凝固。將給藥處理后的HCC-LM3 從培養(yǎng)箱取出，消化離心后收集，采用DMEM 重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，取200 μL 細(xì)胞懸液加入上室。在下室加入500 μL DMEM 全培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中孵育48 h。采用40 g/L 多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，棉簽擦掉上室細(xì)胞，顯微鏡下拍照并進(jìn)行計(jì)數(shù)，侵襲細(xì)胞數(shù)取均值。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 對數(shù)生長期的HCC-LM3按每孔5×105個(gè)接種于6 孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿板底，用200 μL 無菌槍頭，垂直于板底進(jìn)行劃痕，采用PBS 清洗去除劃下的細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)CT-707干預(yù)后，倒置顯微鏡下拍照，并計(jì)算遷移距離。

1.2.5 MTT 實(shí)驗(yàn) 各組對數(shù)期細(xì)胞種植于96 孔板，每孔180 μL，3 000～10 000 個(gè)細(xì)胞/孔。置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)24 h 細(xì)胞貼壁后加入含不同劑量的CT-707 培養(yǎng)，對照組加入空白培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后，棄去培養(yǎng)液，加入90 μL 培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan 溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 處測量各孔的吸光值（OD 值）。按下列算式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=（加藥孔平均OD值－空白孔平均OD 值）/（對照孔平均OD 值－空白孔平均OD 值）×100%。

1.2.6 RT-qPCR HCC-LM3 細(xì)胞經(jīng)CT-707 干預(yù)后，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗2 次，TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃15 min，85 ℃5 min。反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件為95 ℃變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸30 s，45 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。PCR 引物見表1，以β-actin 為內(nèi)參，通過2-△△Ct相對定量法計(jì)算各基因相對表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.2.7 Western blot HCC-LM3 細(xì)胞經(jīng)CT-707 干預(yù)后，加入300 μL RIPA 細(xì)胞裂解液后用刮刀刮取細(xì)胞，置冰上30 min 后，低溫離心20 min，取上清。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，以每泳道20 μg 進(jìn)行樣品配置，100 ℃變性10 min。SDS 電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，分別加入相應(yīng)一抗，4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜3 次，加入相應(yīng)屬源辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL熒光顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，Image J 軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.8 裸鼠皮下移植瘤模型建立及藥物治療 將對數(shù)生長期的HCC-LM3 消化、離心、重懸，制成2.0×107/mL懸液，在常規(guī)消毒的裸鼠腋部皮膚行皮下注射細(xì)胞懸液0.2 mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物3R 原則，將接種HCC-LM3細(xì)胞懸液的裸鼠隨機(jī)分為模型組及CT-707 組，每組6 只。CT-707 組按照20 mg/kg劑量腹腔注射給藥，間隔1 d 注射1 次，模型組則不做任何處理。分別于給藥后9、18、27、36 和45 d 測定瘤體最長直徑（a）和最短直徑（b），計(jì)算移植瘤的體積（V/mm3）=（l/2）×a×b2。給藥45 d 后處死動物，取出移植瘤組織進(jìn)行稱重，計(jì)算抑瘤率（%）=［（模型組平均瘤體質(zhì)量-CT-707 組平均瘤體質(zhì)量）/模型組平均瘤體質(zhì)量］×100%。將取出的腫瘤組織于40 g/L多聚甲醛中固定，行石蠟切片。

1.2.9 HE 染色 取各組移植瘤組織石蠟切片行HE染色。根據(jù)試劑盒說明書操作：二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸洗5 min；蘇木精染色5 min，沖洗殘留染液；滴加體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸酒精進(jìn)行分化，沖洗；滴加體積分?jǐn)?shù)1%氨水反藍(lán)，沖洗；浸入伊紅染液中染色5 min，沖洗；依次進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。切片晾干后鏡檢、拍照。

1.2.10 免疫組化 取各組移植瘤石蠟切片，脫蠟，微波抗原修復(fù)后，滴加體積分?jǐn)?shù)3%H2O2，蒸餾水沖洗干凈。滴加封閉液室溫孵育，加入一抗4 ℃過夜孵育。棄去一抗，PBS 沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育20 min，PBS 沖洗。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20 min，PBS 清洗，DAB顯色，終止，自來水反復(fù)沖洗，蘇木素復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照，Image J 軟件分析FAK、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9的陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，二組計(jì)量資料的均數(shù)比較，如果每一組資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較，各組定量資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CT-707對肝癌細(xì)胞活性、侵襲、遷移的作用

采用MTT、Transwell小室及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞活力、侵襲及遷移能力。結(jié)果顯示，與Control 組比較，CT-707 高、中、低劑量干預(yù)HCCLM3 細(xì)胞可顯著抑制HCC-LM3 細(xì)胞侵襲（F=22.139，P=0.000）、遷移能力（F=35.987，P=0.000），降低細(xì)胞活力（F=43.481，P=0.000；P＜0.05），中、高劑量組的效應(yīng)明顯優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組間結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相較于Control 組，CT-707 低劑量組的細(xì)胞活力（P=0.005）、侵襲能力（P=0.027）和遷移能力（P=0.007）均顯著降低，CT707 中劑量組的細(xì)胞活力（P=0.000）、侵襲能力（P=0.000）和遷移能力（P=0.000）均顯著降低，CT707 高劑量組的細(xì)胞活力（P=0.000）、侵襲能力（P=0.000）和遷移能力（P=0.000）均顯著降低。相較于CT-707 低劑量組，CT707 中劑量組的細(xì)胞活力（P=0.000）、侵襲能力（P=0.001）和遷移能力（P=0.000）均顯著降低，CT707 高劑量組的細(xì)胞活力（P=0.000）、侵襲能力（P=0.000）和遷移能力（P=0.000）均顯著降低。相較于CT-707 中劑量組，CT707 高劑量組的細(xì)胞活力（P=0.283）、侵襲能力（P=0.707）和遷移能力（P=0.869）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1 CT-707對HCC-LM3細(xì)胞活性、侵襲及遷移的影響Fig.1 The effect of CT-707 on the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells

2.2 CT-707 對肝癌細(xì)胞骨架蛋白及基質(zhì)金屬蛋白的作用

采用qPCR 及Western blot 檢測細(xì)胞骨架蛋白（Palladin、Vimentin）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2 和MMP9）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HCC-LM3 經(jīng)高、中、低劑量處理后，與Control 組比較，Palladin（mRNA：F=14.454，P=0.000，protein：F=14.311，P=0.000）、Vimentin（mRNA：F=31.711，P=0.000，protein：F=21.025，P=0.000）、MMP2（mRNA：F=45.341，P=0.000，protein：F=18.685，P=0.000）和MMP9（mRNA：F=21.953，P=0.000，protein：F=15.031，P=0.000）的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組的效應(yīng)明顯優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組間結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

相較于Control 組，CT-707 低劑量組的Palladin（mRNA：P=0.032，protein：P=0.011）、Vimentin（mRNA：P=0.043，protein：P=0.001）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.002）和MMP9（mRNA：P=0.001，protein：P=0.006）的表達(dá)均顯著降低，CT707 中劑量組的Palladin（mRNA：P=0.000，protein：P=0.000）、Vimentin（mRNA：P=0.003，protein：P=0.000）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.000）和MMP9（mRNA：P=0.000，protein：P=0.000）的表達(dá)均顯著降低，CT707 高劑量組的Palladin（mRNA：P=0.000，protein：P=0.000）、Vimentin（mRNA：P=0.002，protein：P=0.000）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.000）和MMP9（mRNA：P=0.000，protein：P=0.000）的表達(dá)均顯著降低。

相較于CT-707 低劑量組，CT707 中劑量組的Palladin（mRNA：P=0.020，protein：P=0.013）、Vimentin（mRNA：P=0.012，protein：P=0.009）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.018）和MMP9（mRNA：P=0.023，protein：P=0.018）的表達(dá)均顯著降低，CT707 高劑量組的Palladin（mRNA：P=0.002，protein：P=0.018）、Vimentin（mRNA：P=0.001，protein：P=0.010）、MMP2（mRNA：，P=0.000，protein：P=0.014）和MMP9（mRNA：P=0.003，protein：P=0.019）的表達(dá)均顯著降低。

相較于CT-707 中劑量組，CT707 高劑量組的Palladin（mRNA：P=0.304，protein：P=0.089）、Vimentin（mRNA：P=0.675，protein：P=0.965）、MMP2（mRNA：，P=0.300，protein：P=0.895）和MMP9（mRNA：P=0.330，protein：P=0.986）的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 CT-707對HCC-LM3細(xì)胞Palladin、Vimentin、MMP2 和MMP9蛋白的作用Fig.2 The effect of CT-707 on the Palladin，Vimentin，MMP2 and MMP9 protein of LM3 cells

2.3 CT-707對FAK/PI3K/Akt信號通路的影響

采用Western blot 檢測FAK、PI3K 和Akt 蛋白及其磷酸化表達(dá)水平。結(jié)果表明，HCC-LM3經(jīng)高、中、低劑量處理后，與Control 組比較，p-FAK/FAK（F=90.258，P=0.000）、p-PI3K/PI3K（F=90.909，P=0.000）、p-Akt/Akt 均顯著下調(diào)（F=115.559，P=0.000；P＜0.05），中、高劑量組的效應(yīng)明顯優(yōu)于低劑量組（P＜0.05），中、高劑量組間結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。相較于Control 組，CT-707 低劑量組的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均顯著降低，CT707 中劑量組的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均顯著降低，CT707 高劑量組的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均顯著降低。相較于CT-707 低劑量組，CT707 中劑量組的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均顯著降低，CT707 高劑量組的p-FAK/FAK（P=0.000）、p-PI3K/PI3K（P=0.000）、p-Akt/Akt（P=0.000）均顯著降低。相較于CT-707中劑量組，CT707高劑量組的p-FAK/FAK（P=0.416）、p-PI3K/PI3K（P=0.132）、p-Akt/Akt（P=0.270）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖3 CT-707對HCC-LM3細(xì)胞中FAK/PI3K/Akt信號通路的影響Fig.3 The effect of CT-707 on the FAK/PI3K/Akt pathway

2.4 CT-707對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

通過計(jì)算裸鼠移植瘤體積及質(zhì)量，結(jié)果顯示，與模型組相比，CT-707 組移植瘤體積［27 d（t=3.030，P=0.013），36 d（t=7.056，P=0.000），45 d（t=8.461，P=0.000）］和質(zhì)量（t=10.510，P=0.000）顯著降低（P＜0.05；圖4），抑瘤率為51.92%；HE 染色結(jié)果顯示，模型組腫瘤細(xì)胞排列緊密、整齊，細(xì)胞核清晰可見，CT-707 組腫瘤組織壞死增多，腫瘤細(xì)胞核消失，細(xì)胞排列松散。

圖4 CT-707對裸鼠皮下移植瘤生長的影響Fig.4 The effect of CT-707 on the growth of subcutaneously transplanted tumors in nude mice

2.5 CT-707 對裸鼠皮下移植瘤FAK/PI3K/Akt 通路關(guān)鍵因子表達(dá)的影響

采用免疫組化檢測裸鼠皮下移植瘤中FAK、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白的陽性表達(dá)，結(jié)果顯示，相較于模型組，CT-707 組FAK（t=5.426，P=0.000）、PI3K（t=7.731，P=0.000）、p-Akt（t=5.930，P=0.000）、MMP-2（t=7.965，P=0.000）、MMP-9（t=7.525，P=0.000）蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05；圖5）。

圖5 FAK、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白的免疫組化檢測結(jié)果Fig.5 Immunohistochemical results of FAK，PI3K，p-Akt，MMP-2，MMP-9 proteins

3 討論

肝癌是我國位列第四的常見惡性腫瘤，且在癌癥相關(guān)死亡原因中位列第三，該病發(fā)病率和死亡率較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及總體生存期［5］。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌治療失敗和死亡的主要原因［6］。腫瘤的轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位，降解周圍基底膜從而穿過血管壁或淋巴管壁，隨血液或淋巴液運(yùn)行并聚集于相應(yīng)器官，在轉(zhuǎn)移器官內(nèi)生長增殖，最終形成繼發(fā)性腫瘤的多步驟過程［7］。肝癌惡性程度高，病情進(jìn)展迅速，臨床確診大多已處于進(jìn)展期或晚期，多伴有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及癌栓，術(shù)后五年生存率僅為12%～14%。隨著腫瘤靶向藥物的開發(fā)使用，尋求靶向腫瘤侵襲遷移相關(guān)蛋白的藥物已成為腫瘤研究熱點(diǎn)。

據(jù)報(bào)道，F(xiàn)AK在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)，且與肝癌細(xì)胞的黏附、播散、遷移和侵襲能力呈正相關(guān)［8］。FAK 參與整合素依賴性信號通路，作為胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多條信號通路及信號通路的交聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性表型和侵襲轉(zhuǎn)移行為［9］。故抑制FAK 的表達(dá)及其下游與腫瘤相關(guān)的傳導(dǎo)通路，是降低肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力的重要策略。目前，開發(fā)靶向FAK的抑制劑是新型抗腫瘤藥物研發(fā)的重要領(lǐng)域［10］。其中CT-707 是一種結(jié)構(gòu)新穎的靶向FAK、ALK 和Pyk2 的多重激酶抑制劑，在促進(jìn)癌細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)良好效果，且與卡博替尼聯(lián)合使用治療肝癌，具有協(xié)同抗腫瘤作用，其機(jī)制為顯著抑制由卡博替尼誘導(dǎo)的FAK 磷酸化激活［11］。本研究選取高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系HCC-LM3進(jìn)行CT-707干預(yù)，發(fā)現(xiàn)CT-707 可顯著抑制HCC-LM3 侵襲、遷移能力，降低癌細(xì)胞活力，表明CT-707對肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移具有明顯的抑制作用。另外，在裸鼠皮下移植瘤模型中，我們發(fā)現(xiàn)CT-707 治療后可顯著降低腫瘤體積及質(zhì)量，抑瘤率為51.92%，且移植瘤細(xì)胞壞死增多，排列松散，進(jìn)一步證實(shí)CT-707可有效抑制腫瘤生長。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移涉及細(xì)胞骨架聚集、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）異常分泌等細(xì)胞活動。支架蛋白Palladin和波形蛋白Vimentin 是細(xì)胞骨架的重要組成部分，與細(xì)胞骨架和細(xì)胞形態(tài)的改變密切相關(guān)。研究表明，Palladin在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過調(diào)控偽足的形成，影響癌細(xì)胞的遷移侵襲，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［12］。而Vimentin 的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和黏附中有具有關(guān)鍵作用，并與癌癥的復(fù)發(fā)密切相關(guān)［13］。MMPs 是一類能降解細(xì)胞外基質(zhì)的高度保守蛋白水解酶，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要意義，可通過降解破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤，最終導(dǎo)致腫瘤局部侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［14］。其中，MMP2 和MMP9 在肝癌組織中高表達(dá)，通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞和基質(zhì)的黏附等方式加速肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移［15-16］。因此，本研究選取Palladin、Vimentin、MMP2 及MMP9 作為肝癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志蛋白。HCC-LM3 細(xì)胞經(jīng)CT-707 干預(yù)后，Palladin、Vimentin、MMP2 及MMP9 蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，且動物實(shí)驗(yàn)也顯示裸鼠移植瘤模型經(jīng)CT-707治療后，顯著降低了腫瘤組織中MMP2 及MMP9 陽性表達(dá)，表明CT-707可通過降低骨架蛋白及MMPs的表達(dá)，進(jìn)而降低細(xì)胞的侵襲及遷移能力，從而發(fā)揮抑癌作用。

FAK 可通過多條信號通路參與細(xì)胞骨架重排及MMPs 的分泌過程，其中PI3K/Akt是FAK 經(jīng)典下游通路，參與調(diào)控腫瘤的增殖、黏附及遷移，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［17］。Palladin、Vimentin 是Akt 下游蛋白，激活A(yù)kt 可直接促進(jìn)Palladin、Vimentin 的表達(dá)［18-19］。研究表明，抑制PI3K/Akt 信號通路還可進(jìn)一步抑制MMP2、MMP9 的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移［20］。由此，我們推測CT-707可能通過調(diào)控FAK/PI3K/Akt信號通路活性從而抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移。通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)HCC-LM3 細(xì)胞經(jīng)CT-707 干預(yù)后，p-FAK/FAK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 均顯著下降，表明抑制FAK/PI3K/Akt 信號通路活性是CT-707 發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵機(jī)制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CT-707抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制，我們進(jìn)行了裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)模型鼠經(jīng)CT-707 治療后，F(xiàn)AK、PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)均顯著降低，表明CT-707 可通過抑制FAK/PI3K/Akt 信號通路活性進(jìn)而抑制腫瘤的形成。

綜上所述，本研究證實(shí)FAK 新型抑制劑CT-707 可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移以及腫瘤生長，其機(jī)制為抑制FAK/PI3K/Akt 信號通路活性，從而抑制細(xì)胞骨架重排及MMPs 分泌，表明CT-707 作為一種FAK 靶向抑制劑具有良好的癌細(xì)抑制作用，可能是潛在的腫瘤靶向藥物，值得深入研究。