加氏乳桿菌對潰瘍性結腸炎小鼠黏膜的干預作用

簡正陽，陳佳敏，劉 秀，賀 青

（1.中山大學附屬第六醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，廣東廣州 510610；2.中山大學附屬第六醫(yī)院消化內科，廣東廣州 510610；3.中山大學中山醫(yī)學院藥理教研室，廣東廣州 510080）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性和復發(fā)性胃腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩?。–rohn′s disease，CD）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）。我國IBD 的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢［1］。IBD的發(fā)病機制與嚴重程度受到多種因素影響，其中主要包括遺傳因素、免疫反應、腸道菌群和氧化應激等［2］。目前治療IBD 的藥物包括氨基水楊酸（美沙拉秦）、皮質類固醇、生物制劑和免疫抑制劑等，主要通過抑制炎癥發(fā)揮作用，存在價格昂貴、副作用多、部分患者療效不佳、不能根治等不足。因此，尋找更為安全有效的治療藥物是IBD研究的熱點之一。IBD的突出特征之一是腸道菌群的改變［3］，包括：腸道菌群的多樣性下降，變形菌門增加特別是侵襲性大腸桿菌等致病菌占比增高，有益菌屬（擬桿菌屬、乳桿菌屬和真桿菌屬等）顯著減少。補充有益菌或者針對性的補充IBD患者缺乏的菌群可能有助于IBD的治療。益生菌是通過定殖在人體內，改變宿主某一部位菌群組成的一類對宿主有益的活性微生物。益生菌主要包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、糞腸球菌以及不斷被發(fā)現(xiàn)的新有益菌株，已有的基礎研究和臨床研究發(fā)現(xiàn)益生菌在胃腸道疾病、自閉癥、阿爾茲海默癥、代謝綜合征等疾病有一定的治療功效［4］，部分菌株對疾病的治療有較顯著的效果［5］，其作用機制包括改善腸道微生態(tài)平衡、修復腸黏膜屏障、抑制腸粘膜炎癥［6-8］等。但是目前尚無明確可替代現(xiàn)階段一線治療藥物的益生菌株用于臨床治療IBD。因此，需要尋找高效安全的益生菌株作為IBD 的治療新選擇。本課題組與華大基因公司合作，通過比較IBD 患者與健康個體腸道菌群的差異，并分析了經腸內營養(yǎng)治療的IBD 患者以及三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS）誘導的IBD 小鼠腸道菌群的變化，找出了改變突出的益生菌［9-10］，通過篩選，分離制備出具有顯著抗炎作用的益生菌加氏乳桿菌TF08-1（lactobacillus gasseri TF08-1），并進行了毒理實驗，確認了安全性。為進一步明確加氏乳桿菌TF08-1對于IBD的作用及其機制，本實驗以葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導的潰瘍性結腸炎小鼠模型為對象，美沙拉秦作為陽性對照治療的藥物，分析加氏乳桿菌TF08-1對潰瘍性結腸炎的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 24 只雄性5～8 周齡C57BL/6N 小鼠，SPF 級，體質量20～25 g，購于北京維通利華有限公司【許可證號：SCXK（京）2016-0006】，飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心，環(huán)境溫度（25±3）℃，濕度（55±5）%以及12 h 光/暗循環(huán)，許可證號：SYXK（粵）2017-0081。本研究符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》以及國家醫(yī)藥管理局頒布的《實驗動物管理實施細則》，涉及的所有內容符合中山大學倫理委員會要求。

1.1.2 主要試劑 加氏乳桿菌TF08-1 經復蘇培養(yǎng)制備成含有1×1010CFU/mL 菌液，4 ℃保存?zhèn)溆?；MRS培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，美沙拉秦購自美侖生物技術有限公司，DSS 購自MP Biomedicals 公司，隱血試劑盒購自廣州吉捷生物科技有限公司，TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自Sigma-Aldrich 公司，IL-10 ELISA 試劑盒購自博士德生物有限公司，TNF-αELISA 試劑盒購自欣博盛生物有限公司，BCA 試劑盒購自碧云天生物技術研究所，Bcl-2、GAPDH 一抗、二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 實驗儀器 Western blot 制膠板、Western blot 電泳轉槽（美國Bio Rad 公司），Western blot 熒光感應曝光機（美國Odyssey 公司），酶標儀（奧地利TECAN公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Nikon）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化 將保存于4 ℃的加氏乳桿菌TF08-1 以20 g/L 的接種量接種在MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)兩代后備用。

1.2.2 葡聚糖硫酸鈉誘導腸炎模型 將24 只8 周齡C57BL/6N 小鼠隨機分為4 組，每組6 只，即對照組（Control 組）、模型組（DSS 組）、美沙拉秦組（5-ASA+DSS 組）、加氏乳桿菌組（TF08-1+DSS 組）。適應性飼養(yǎng)1 周后，對照組小鼠自由飲水，其余各組飲用水換為含有30 g/L DSS 的飲用水自由飲用7 d誘導小鼠IBD模型［11］。對照組及模型組每天用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）灌胃0.2 mL/d，美沙拉秦組將美沙拉秦溶于PBS 中，按30 mg/kg 灌胃小鼠，加氏乳桿菌TF08-1組按2×109CFU灌胃，其余飼養(yǎng)條件如溫度、濕度、光照、飼料均一致，每天監(jiān)測體質量，大便性狀以及大便隱血情況，第8 天處死小鼠，整個實驗過程持續(xù)1周。

1.2.3 小鼠一般情況評估 在小鼠給藥期間，每日記錄小鼠體質量變化、活動狀態(tài)、糞便狀態(tài)和便血情況等，按照文獻所述的方法進行腸炎疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分并統(tǒng)計［12］。造模7 d后處死小鼠，立即取出結腸，測量盲腸末端和近端直腸之間的結腸長度。

1.2.4 組織病理學分析 小鼠處死后，于肛門上1 cm 處取長約1.5 cm 的小鼠結腸組織，縱行剖開后采用40 g/L 多聚甲醛溶液脫水固定，室溫靜置24 h后用不同濃度乙醇溶液梯度脫水，二甲苯透明處理，最后進行石蠟包埋。并用石蠟切片機將組織沿著腸軸縱行切成4 mm 厚度切片貼于載玻片上。用蘇木精染色后，經過漂洗脫水后，用酒精伊紅染色液染色，經過純酒精脫水，浸泡二甲苯使之透明，中性樹脂封片后于光學顯微鏡下觀察腸道病理改變并拍照。根據IBD 病理評分標準對每張病理切片進行評分［13］，記錄并統(tǒng)計評分結果。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測腸組織炎癥細胞因子 于肛門上2.5 cm 處取腸組織，用預冷的PBS 中清洗血液，稱取腸壁組織20 mg，加入180 μL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS；質量體積比1：9），用眼科剪于冰上剪碎組織塊，并于冰上研磨。超聲機超聲勻漿后，離心機4 ℃，3 000 r/min（r=7 cm），離心15 min，將離心過的勻漿液去沉淀，留上清。將上清凍存于-80 ℃。利用BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），復溫溶解后測定蛋白質濃度，并根據總蛋白質濃度稀釋到相應的倍數。然后利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒，嚴格按照說明書測定IL-10 和TNF-α 的濃度，最終根據總蛋白濃度計算出單位體積的蛋白質中IL-10 和TNF-α的濃度。

1.2.6 蛋白免疫印跡 處死小鼠后在距肛門上0.5 cm 處取新鮮結腸組織20 mg，加入300 μL 蛋白裂解液后剪碎后超聲裂解勻漿，4 ℃冰箱靜置30 min。置于4 ℃離心機12 000 r/min（r=7 cm）離心30 min 取上清。用BCA 法檢測所提取蛋白的總濃度，根據檢測濃度將蛋白樣品稀釋成等體積等濃度蛋白樣品，按4：1 加入Loading Buffer 后混勻98 ℃水浴變性5 min，-80 ℃冰箱保存。配制12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，以400 mA 的恒流下轉膜1.5 h，然后用體積分數5%牛血清白蛋白封閉液室溫下封閉PVDF 膜1 h。封閉結束后，TBST清洗，將相應的條帶放入稀釋的BCL-2 或GAPDH稀釋液中，4 ℃孵育過夜，用TBST 清洗后再置于相應的二抗稀釋液中常溫孵育2 h，滴加顯影液，顯影并采集圖像。

1.2.7 結腸細胞凋亡檢測 取冰凍切片，37 ℃溫箱孵育1 h，用PBS 溶液清洗OCT 膠，并將切片浸入枸櫞酸溶液室溫靜置8 min。PBS 清洗后用TUNEL試劑盒按照說明書進行凋亡細胞染色，再用PBS清洗后滴加DAPI 室溫孵育5 min，PBS 漂洗，用抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）封片。將切片置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察結果并采集圖像。

1.2.8 統(tǒng)計學處理 本實驗所有數據采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用GrapPad Prism 8.0 畫圖，滿足正態(tài)分布的計量數據以均數±標準差表示，結腸長度，組織病理評分，炎性因子水平，Bcl-2 表達量經過正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗確認為服從正態(tài)分布且方差齊后，采用單因素方差分析（One way-ANOVA），多組比較有統(tǒng)計學意義后采用Dunnett’st檢驗進行兩兩比較，所有統(tǒng)計學分析均為雙側檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 加氏乳桿菌抑制葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結腸炎小鼠的炎癥表現(xiàn)

30 g/L DSS誘導潰瘍性結腸炎后，模型組、加氏乳桿菌組和美沙拉秦組小鼠體質量在第4 天均明顯下降，之后加氏乳桿菌組和美沙拉秦組下降速度均慢于模型組（圖1A）；模型組、加氏乳桿菌組和美沙拉秦組DAI 評分在DSS 誘導后逐日升高，加氏乳桿菌組和美沙拉秦組DAI 評分均低于模型組（圖1B）；處死小鼠后，模型組、加氏乳桿菌組和美沙拉秦組小鼠結腸明顯縮短，與模型組比較，加氏乳桿菌組和美沙拉秦組結腸長度縮短程度較輕，單因素方差分析結果顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=10.98，P=0.000 2）。組間兩兩比較顯示：與模型組［（6.28 ±0.36）cm］相比，加氏乳桿菌組［（7.74±0.29）cm］和美沙拉秦組［（7.22±0.71）cm］結腸結腸縮短程度均減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.001；圖1C）；加氏乳桿菌組體質量下降程度、DSS 評分和結腸縮短程度雖均優(yōu)于美沙拉秦組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 加氏乳桿菌緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸組織損傷

小鼠結腸組織HE 染色后鏡下觀察和進行評分。鏡下觀察，對照組結腸組織結構完整，無炎性細胞浸潤（圖2A）；模型組有明顯炎性細胞浸潤，上皮細胞大量脫落，肌層變厚（圖2B）；加氏乳桿菌組和美沙拉秦組病理損傷較輕，腺體結構并未完全消失，炎性細胞浸潤程度較淺，上皮層細胞尚存（圖2C、D）。結腸組織病理學評分采用單因素方差分析，結果顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=10.12，P=0.001 6），組間兩兩比較顯示：美沙拉秦組（3.67±2.25）、加氏乳桿菌組（2.83±1.94）與模型組（7.17±0.75）相比明顯有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；P＜0.05）。加氏乳桿菌炎癥程度略輕于美沙拉秦組，但是兩組結腸組織損傷差異并無統(tǒng)計學意義（P=0.79；圖2E）。

2.3 加氏乳桿菌抑制葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸組織炎性細胞因子分泌

各組小鼠結腸組織中IL-10、TNF-α 促炎細胞因子的水平經ELISA 試劑盒檢測后。小鼠結腸組織中的IL-10 水平經單因素方差分析結果顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=5.53，P=0.017）。組間兩兩比較采取Dunnettt檢驗分析，結果顯示：和對照組比較，模型組結腸組織中IL-10 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義［（95.01±53.73）pg/mLvs.（277.33±64.63）pg/mL，P＜0.05］，美沙拉秦組和模型組比較，IL-10水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義［（121.32±72.72）pg/mLvs.（277.33±64.63）pg/mL，P＜0.05］，加氏乳桿菌組和模型組比較，IL-10水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義［（156.21±97.19）pg/mLvs.（277.33±64.63）pg/mL，P＜0.05］。加氏乳桿菌組和美沙拉秦組IL-10 含量比較，差異無統(tǒng)計學意義［（156.21±97.19）pg/mLvs.（121.32±72.72）pg/mL，P=0.50；圖3A］。小鼠結腸組織中的TNF-α 水平經單因素方差分析結果顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=5.32，P=0.019）。組間兩兩比較采取Dunnettt檢驗分析，結果顯示：和對照組比較，模型組結腸組織中TNF-α 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義［（315.07±218.42）pg/mLvs.（691.02±239.81）pg/mL，P＜0.05］，美沙拉秦組和模型組比較，TNF-α 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義［（411.19±81.33）pg/mLvs.（691.02±239.81）pg/mL，P＜0.05］，加氏乳桿菌組和模型組比較，TNF-α 水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義［（438.46±117.20）pg/mLvs.（691.02±239.81）pg/mL，P＜0.05］。加氏乳桿菌組和美沙拉秦組TNF-α含量比較，差異無統(tǒng)計學意義［（438.46±117.20）pg/mLvs.（411.19±81.33）pg/mL，P=0.65；圖3B］。

圖2 小鼠結腸組織病理染色和分析Fig.2 Histopathological changes of colons in each group

2.4 加氏乳桿菌上調凋亡相關蛋白的表達

Western blot 結果經單因素方差分析顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=10.05，P=0.004 3）。組間兩兩比較采取Dunnettt檢驗分析，結果顯示：美沙拉秦組Bcl-2 表達量升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖4）。加氏乳桿菌組Bcl-2 表達量升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖4）。加氏乳桿菌組和美沙拉秦組蛋白表達量比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 小鼠腸組織細胞因子IL-10、TNF-α表達量Fig.3 Expression levels of cytokines IL-10 and TNF-α in intestinal tissues of mice

圖4 小鼠腸組織Bcl-2表達量Fig.4 The expression level of Bcl-2 in intestinal tissues of mice

2.5 加氏乳桿菌對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠腸道細胞凋亡的影響。

結腸組織冰凍切片后采用TUNEL 染色檢測組織凋亡情況，結果顯示，模型組和對照組相比，腸組織黏膜綠色凋亡細胞顯著增加，加氏乳桿菌組和美沙拉秦組綠色凋亡的細胞明顯減少（圖5）。

圖5 小鼠腸組織TUNEL染色Fig.5 TUNEL staining of mouse intestinal tissue

3 討論

炎癥性腸病是一種主要累及整個消化道的慢性非特異性炎性疾?。?4-15］，嚴重時可并發(fā)消化道穿孔、大出血、中毒性巨結腸和腫瘤，目前尚無法治愈，藥物和手術治療的預后均不理想。因此尋找新的IBD 治療方案尤為重要。益生菌作為對人體有益的活性微生物制劑，在用于治療IBD 的相關研究中一直備受關注，臨床研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Nissle 1917 在誘導和維持UC 緩解方面作用接近美沙拉秦［16-17］。Tursi［18］報道了復合益生菌VSL#3 作為標準藥物治療的輔助劑，可以緩解輕中度UC 復發(fā)患者的病情，但是對于重度患者效果較差。這些均證明益生菌在IBD 的治療上具有廣闊前景，需要研發(fā)更為有效的益生菌株。

加氏乳桿菌TF08-1是我們和華大基因共同研發(fā)分離的新型益生菌，具有良好的抗炎效果。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在DSS誘導小鼠潰瘍性結腸炎疾病模型中，小鼠出現(xiàn)明顯體質量下降、血便、結腸縮短，組織病理切片發(fā)現(xiàn)腸黏膜正常結構消失，大量炎性細胞浸潤，加氏乳桿菌TF08-1 能抑制潰瘍性結腸炎小鼠體質量下降趨勢，降低DAI 評分，改善結腸病理損傷。美沙拉秦作為UC 的一線治療藥物，雖然對于重度的UC 往往無效，對于輕中度的UC 能夠減輕炎癥、誘導黏膜愈合。在本研究中加氏乳桿菌TF08-1 效果與美沙拉秦相當，提示加氏乳桿菌TF08-1 對DSS 誘導的小鼠潰瘍性結腸炎具有緩解作用。遺傳和免疫學研究表明，細胞炎性因子直接參與了IBD 的發(fā)病機理，在調控腸道炎癥和IBD 相關的臨床癥狀中起著重要的作用［19］，在IBD的小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，可通過調節(jié)細胞因子功能進而治療IBD［20］。例如，TNF-α 的阻斷已經在臨床上用于治療IBD［21］，因此，我們檢測了結腸組織中IL-10 和TNF-α 水平，加氏乳桿菌TF08-1 可顯著下調DSS 鼠的IL-10 和TNF-α 水平，與美沙拉秦治療組比較差異無統(tǒng)計學意義，可以認為加氏乳桿菌TF08-1 具有良好的抗炎作用，作用效果接近美沙拉秦。

腸粘膜細胞的異常死亡是炎癥性腸病的發(fā)病機制之一，腸黏膜細胞死亡方式包括凋亡、失巢凋亡、細胞焦亡、壞死性死亡等［22］，腸粘膜細胞的異常凋亡與IBD 炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關［23］，本研究首先通過檢測腸組織凋亡抑制蛋白B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）表達量，發(fā)現(xiàn)DSS 誘導的模型鼠腸組織Bcl-2 表達量明顯下降，加氏乳桿菌組Bcl-2 表達量明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學意義，表明腸黏膜組織細胞凋亡水平受到明顯抑制，其結果與美沙拉秦組相當。TUNEL 染色結果顯示，DSS誘導的模型組腸黏膜細胞凋亡細胞明顯增多，這表明腸粘膜細胞的凋亡在IBD 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，加氏乳桿菌組腸黏膜細胞凋亡明顯降低，尤其腸黏膜上皮細胞凋亡明顯減少，其結果與美沙拉秦組相當，這表明加氏乳桿菌可能通過抑制腸黏膜細胞凋亡進而緩解IBD 表現(xiàn)。這些結果表明加氏乳桿菌TF08-1 和美沙拉秦均可緩解小鼠潰瘍性結腸炎，且療效相近，其機制可能與抑制腸上皮細胞凋亡相關。

本研究尚存在以下不足，首先，經過加氏乳桿菌TF08-1 干預后TNF-α 水平降低，表明結腸炎癥得到了很好的抑制，但是抗炎因子IL-10 經過干預后也同步降低，這提示加氏乳桿菌可能通過其他炎性因子調控結腸炎［24-26］。在后續(xù)研究中需要進一步檢測血清、組織中各類炎性因子水平，進一步明確其在炎性調控中的作用。其次，目前本研究發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌TF08-1的緩解潰瘍性結腸炎的作用機制可能與線粒體通路介導的凋亡相關，但是需要用特異性信號通路抑制劑進一步進行實驗驗證。最后，TF08-1 還可能影響腸道其他的微生物及黏膜屏障，尚需要進一步試驗進行驗證。我們將在后續(xù)研究中擴大樣本量，進一步通過急性炎癥模型和慢性炎癥模型探究加氏乳桿菌對UC 的療效及其機制。

綜上所述，本研究證明加氏乳桿菌TF08-1 可以改善DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎，且療效接近美沙拉秦，其作用機制可能與抑制腸黏膜細胞凋亡相關。本研究證明了一個新型菌株的有效性，口服益生菌或可作為IBD治療的有效手段之一。