郁金配方顆粒HPLC指紋圖譜及指標成分含量測定研究*

姚 瑤，趙淑淑，姚俊霞，黃 琪，朱方劍，信文娟

（浙江佐力藥業(yè)股份有限公司，浙江 湖州 313200）

郁金為姜科植物溫郁金Curcumawenyujin Y.H.Chen et C.Ling、姜黃Curcuma longa L.、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Val.的干燥塊根［1］。溫郁金是浙八味的道地藥材，具有行氣解郁、活血止痛、利膽退黃等功效［2］。現(xiàn)代研究表明，溫郁金藥材中含有0.3%的揮發(fā)油，主要成分有莪術(shù)醇、吉馬酮、異龍腦、龍腦等［3-5］。郁金配方顆粒以郁金藥材為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥等工序制備而成。目前，市場上郁金配方顆粒生產(chǎn)廠家較多，為保證其治療效果穩(wěn)定，需對產(chǎn)品進行質(zhì)量控制。本研究中建立了郁金配方顆粒高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并同時測定制劑中尿苷、腺苷的含量，為中藥配方顆粒的質(zhì)量研究提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260-G205型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BT25S型電子分析天平（瑞士Sartorius公司，精度為0.01 mg）；KQ-500VDB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

郁金配方顆粒（4個不同廠家，批號分別為1906001，191001，1911003，Y20190411）；尿苷對照品（批號為110887-201803，含量為99.5%），腺苷對照品（批號為110879-201703，含量為99.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch UltimateAQ-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸二氫鉀溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時0A，10～20 min時0 A→2%A，20～30 min時2%A→10%A，30～45 min時10%A→15%A，45～55 min時15%A）；流速：0.8 mL／min；檢測波長：260 nm；柱溫：30℃。

2.2 溶液制備

取尿苷、腺苷對照品各適量，精密稱定，加水制成每1 mL分別含尿苷和腺苷各10μg的混合對照品溶液。取樣品（批號為1906001）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，離心，取上清液5 mL，蒸干，殘渣用10%甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按郁金配方顆粒處方和工藝制備缺尿苷、腺苷的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 方法學考察

精密度試驗：分別精密吸取供試品（批號為1906001）溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定6次，以腺苷峰為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD均小于1.00%，相對峰面積的RSD均小于2.00%（n＝6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品（批號為1906001）溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以腺苷峰為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.00%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為1906001）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，以腺苷峰為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD均小于1.00%，相對峰面積的RSD均小于2.00%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.3.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

按郁金配方顆粒處方制備15批煎劑。按2.1項下色譜條件進樣測定，15批煎劑HPLC疊加指紋圖譜見圖1。根據(jù)結(jié)果，采用Chempattern化學計量學軟件分析數(shù)據(jù)，設(shè)樣品（批號為1906001）的色譜圖為參照圖譜，其他樣品的色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，即得郁金配方顆粒HPLC對照指紋圖譜，詳見圖2。將15批煎劑的色譜圖錄入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”，確定1號峰為尿苷，3號峰為腺苷，并計算相似度。相似度結(jié)果均大于0.85，說明15批煎劑間具有較好的相似性，結(jié)果見表1。

2.3.3 樣品相似度評價

圖1 15批標準煎劑高效液相色譜重疊指紋圖譜Fig.1 HPLC overlapping fingerprint of 15 batches of Curcumae Radix standard decoction

圖2 郁金配方顆粒高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of Yujin Dispensing Granules

取4批市售樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并計算相似度。結(jié)果，供試品特征圖譜中呈現(xiàn)3個共有峰，并與參照物色譜峰中的保留時間相對應(yīng)，供試品溶液與對照指紋圖譜相似度均大于0.85。結(jié)果見表2。

2.4 指標成分含量測定

2.4.1 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖3。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在與阿魏酸對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下混合對照品溶液，制成尿苷／腺苷質(zhì)量濃度分別為26.44／79.26，13.22／39.63，5.09／15.85，3.05／9.51，1.02／3.17，0.51／1.59μg／mL的系列混合對照品溶液。精密量取10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（X，ng）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得尿苷和腺苷的回歸方程Y1＝2.3995X1＋4.0551，Y2＝3.216 8X2＋7.689 5，r均為0.999 7（n＝6）。結(jié)果表明，尿苷和腺苷進樣量分別在5.1～264.4 ng和15.9～792.6 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 15批煎劑相似度評價結(jié)果Tab.1 Similarity of 15 batches of decoction

表2 4個廠家郁金配方顆粒相似度評價結(jié)果Tab.2 Similarity of Yujin Dispensing Granules from four manufacturers

圖3 高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms

精密度試驗：取線性關(guān)系考察項下第一組混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果尿苷和腺苷峰面積的RSD分別為0.25%和0.13%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液（批號為1906001）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，18，24 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果尿苷和腺苷峰面積的RSD分別為1.70%和0.96%（n＝7），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為1906001）適量，精密稱定，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果尿苷和腺苷平均含量分別為0.0463，0.091 2 mg／g，RSD分別為1.50%和1.90%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為1906001，尿苷含量為0.046 5 mg／g、腺苷含量為0.091 1 mg／g）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery tests（n＝6）

2.4.2 樣品含量測定

取4批樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果4批樣品中尿苷含量分別為0.043，0.013，0.048，0.035 mg／g，腺苷含量分別為0.098，0.012，0.058，0.058 mg／g。

3 討論

郁金的主要來源為溫莪術(shù)根莖或郁金塊莖，浙江是其主產(chǎn)區(qū)。郝敏等［6］研究發(fā)現(xiàn)，不同品種郁金的指紋圖譜具有相似性，其揮發(fā)油指紋圖譜中均含有吉馬酮等化學成分。劉玉紅等［7］建立了4種不同基源的郁金揮發(fā)油指紋圖譜方法，為郁金藥材質(zhì)量標準的制訂提供了依據(jù)。目前，有關(guān)郁金含量測定研究主要集中于藥材及其揮發(fā)油的研究，有關(guān)郁金配方顆粒中指標成分含量測定鮮有報道。本研究中采用HPLC法，比較不同波長、不同流動相（甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、醋酸-乙腈-水）［8-10］對樣品含量測定結(jié)果的影響，最終確定為以甲醇-0.1%磷酸二氫鉀溶液為流動相進行梯度洗脫，測定波長為260 nm。

中藥配方顆粒經(jīng)過多工序加工而成，失去了原有飲片的形態(tài)，在質(zhì)量控制上缺少飲片性狀等重要指標，因此在質(zhì)量控制標準制訂過程中應(yīng)加強有效成分多元化測定及測定指標多樣化。中藥指紋圖譜屬中藥質(zhì)量控制的新技術(shù)，能有效且全面地反映其整體特性。本研究通過15批標準湯劑擬合出對照指紋圖譜，并與市售4批樣品比較，指認3個共有峰，且相似度均大于0.85。

綜上所述，該方法操作簡便、準確，重復性好，結(jié)合所建立的指紋圖譜，可為郁金配方顆粒的質(zhì)量評價提供參考。