桑葚對非酒精性脂肪性肝病模型大鼠脂質(zhì)代謝的影響

蔣 焱 蔣素文 胡愛榮 孟依娜 陸佳林 何哲耘

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為發(fā)病率最高的慢性肝病，亞洲NAFLD 的總體患病率29.62%，其中我國大陸一般人群的患病率29.81%[1-2]。NAFLD 持續(xù)進展可直接導(dǎo)致肝硬化等終末期肝病，而且還可影響并參與病毒性肝炎等其他肝臟疾病、脂質(zhì)代謝紊亂、2 型糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝綜合征各組分的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。然而，NAFLD 及相關(guān)疾病的治療方式和藥物均無滿意療效[3，5]。桑葚是一種“藥食同源”的漿果，具有多種藥學(xué)效應(yīng)和藥用價值，對糖尿病、心血管疾病等代謝綜合征有較好的防治作用[6-7]。本研究以高脂飲食誘導(dǎo)大鼠NAFLD 模型，探討桑葚對NAFLD 脂質(zhì)代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量140～170g；購于上海杰思捷實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004，合格證編號：20170005009340。于清潔級動物房分籠飼養(yǎng)，模擬24h 晝夜循環(huán)光照條件下自由攝食、飲水。實驗符合動物倫理規(guī)范（2017-036）。

1.2 藥物桑葚標(biāo)準(zhǔn)提取物（GMP 標(biāo)準(zhǔn)）購于西安普瑞斯生物工程有限公司（批號ZHH20190429），陽性對照護肝藥異甘草酸鎂注射液購于南京正大天晴制藥有限公司（批號190604104）。

1.3 檢測試劑與儀器 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒購自寧波賽克生物技術(shù)有限公司（批號C010-2-1、C009-2-1），三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1）。病理組織切片機及組織包埋儀為德國Leica 公司生產(chǎn)，動物生化分析儀iMagic-V7 為深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.4 動物模型復(fù)制及分組給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按數(shù)字表法隨機分為正常組10 只和造模組50只，正常組給予正常飼料，造模組給予高脂飼料，高脂飼料配方為10%豬油+2%膽固醇+88%基礎(chǔ)飼料。于第8 周末取大鼠肝臟組織油紅O 染色及HE 染色判斷造模是否成功。于第9 周起，再將造模組大鼠隨機分為模型組、桑葚低、中、高劑量組、異甘草酸鎂對照組，每組10 只。實驗組大鼠灌胃給予對應(yīng)藥物，正常組與模型組大鼠予等量生理鹽水，灌胃量1mL/100g，持續(xù)6 周，并監(jiān)測大鼠體質(zhì)量和攝食狀況。桑葚水提取物的給藥劑量參照文獻[8]，低、中、高劑量分別為2.5、5、10g/kg，異甘草酸鎂的給藥劑量為按體表面積計算相當(dāng)于成人臨床推薦劑量，將原液稀釋至1g/L，15mL·kg-1·d-1[9]。

1.5 標(biāo)本留取 第14 周末用藥周期完成后，所有大鼠禁食12h，以10%水合氯醛3mL/kg 腹腔注射麻醉。下腔靜脈采血2mL，離心5min（離心轉(zhuǎn)速=3000rpm、半徑=7cm）后取血清，用于肝功能及血脂檢測。開腹取出肝臟稱重，并拍照大體觀，觀察肝臟大小、形態(tài)、色澤、邊緣等情況，計算肝臟指數(shù)（肝濕重/體質(zhì)量×100%）。部分肝臟組織以10%中性甲醛緩沖液固定，行油紅O 染色及HE 染色。

1.6 指標(biāo)測定 肝臟組織固定后，常規(guī)石蠟包埋，5μm 切片，油紅O 染色觀察肝組織中的脂滴分布狀況，HE 染色觀察肝臟病理學(xué)改變。血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C、HDL-C 等指標(biāo)檢測參照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較用單因素方差分析及兩兩比較，分析前行方差齊性檢驗，方差齊時用SNK 法，方差不齊時用Tambane's法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟大體觀 正常組大鼠肝臟色澤紅潤、邊緣銳利，模型組的肝臟體積增大、色澤較為灰白、邊緣變鈍，各干預(yù)組肝臟大體色澤的紅潤度均有一定改善，以桑葚高劑量組的改善最為明顯。見圖1。

圖1 大鼠肝臟大體觀

2.2 各組大鼠肝臟指數(shù)比較 與正常組比較，模型組、桑葚低、中、高劑量組、異甘草酸鎂對照組的肝臟指數(shù)均降低（P 均<0.01）。與模型組比較，而各藥物干預(yù)組肝臟指數(shù)均升高；桑葚中、高劑量組及異甘草酸鎂對照組的改善最為顯著（P<0.01 或P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)比較（）

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)比較（）

注：正常組與模型組給予等量生理鹽水；桑葚低、中、高劑量組分別予2.5、5、10g·kg-1·d-1 水提取物灌胃；異甘草酸鎂對照組予15mL·kg-1·d-1異甘草酸鎂灌胃；與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與桑葚低劑量組比較，cP<0.05，ccP<0.01

2.3 各組大鼠肝組織病理改變 油紅O 染色可特異性顯示肝組織內(nèi)的脂肪沉積程度，脂滴呈紅色，細胞核藍色。正常組肝細胞形態(tài)正常，未見任何脂滴。模型組肝細胞油紅O 染色強陽性，紅色脂滴片狀聚集，脂滴細胞數(shù)/總細胞數(shù)為60%～70%。桑葚低劑量組及中劑量組仍可見一定程度的脂肪沉積，脂滴細胞數(shù)/總細胞數(shù)分布為20%～30%、10%～15%，且隨著桑葚劑量的增加而逐漸改善。桑葚高劑量組及異甘草酸鎂對照組肝臟脂肪沉積顯著改善，與正常組接近。見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織脂滴分布狀況（油紅O 染色法）

HE 染色正常組肝細胞形態(tài)正常，大小均勻，肝索呈放射狀整齊排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，未見任何病理改變。模型組肝細胞腫大，胞漿疏松，胞漿內(nèi)可見脂滴空泡將細胞核擠向一邊，嚴(yán)重者出現(xiàn)氣球樣變，肝索排列紊亂，匯管區(qū)可見一定的炎性細胞浸潤。與模型組相比，各干預(yù)組均有不同程度改善。桑葚低、中劑量組仍可見脂滴空泡，但肝索排列及細胞腫大較模型組改善。桑葚高劑量組及異甘草酸鎂對照組肝細胞脂肪變性明顯改善，細胞核大小較正常，肝索排列較整齊，優(yōu)于桑葚低、中劑量組。見圖3。

圖3 各組大鼠肝組織病理改變（HE 染色）

2.4 各組大鼠血清肝功能及脂質(zhì)代謝指標(biāo)比較 與正常組比較，模型組血清ALT、AST 顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各干預(yù)組大鼠血清ALT、AST均明顯降低（P 均<0.01）；桑葚干預(yù)組的改善呈劑量依賴性，以桑葚高劑量組的療效改善最為顯著，與正常組相近，桑甚高劑量組與正常組兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC 及LDL-C 均明顯升高（P<0.01），HDL-C明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，桑葚低、中、高劑量組及異甘草酸鎂對照組血清TG 與LDL-C 均顯著下降（P<0.01），桑葚高劑量組及異甘草酸鎂組血清TC 顯著下降（P<0.01），桑葚低、中劑量組血清HDLC 顯著上升（P<0.01，P<0.05）。與異甘草酸鎂組比較，桑葚高劑量組血清TG、LDL-C 下降更明顯（P 均<0.01），桑葚低、中劑量組血清HDL-C 上升更明顯（P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清肝功能及脂質(zhì)代謝指標(biāo)比較（）

表2 各組大鼠血清肝功能及脂質(zhì)代謝指標(biāo)比較（）

注：正常組與模型組給予等量生理鹽水；桑葚低、中、高劑量組分別予2.5、5、10g·kg-1·d-1 水提取物灌胃；異甘草酸鎂對照組予15mL·kg-1·d-1 異甘草酸鎂灌胃；ALT 為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST 為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；TG 為三酰甘油；TC 為總膽固醇；LDL-C 為低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C 為高密度脂蛋白膽固醇；與正常組比較，aP<0.05，aaP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，bbP<0.01；與異甘草酸鎂對照組比較，cP<0.05，ccP<0.01

3 討論

NAFLD 與胰島素抵抗、遺傳易感性和糖脂代謝紊亂等因素密切相關(guān)，為多系統(tǒng)代謝功能異常累及肝臟的表現(xiàn)[10]。因此，最近多位國際脂肪肝領(lǐng)域的臨床專家聯(lián)合建議將NAFLD 更名為代謝相關(guān)脂肪性肝?。∕AFLD）[11]。隨著肥胖及相關(guān)疾病的全球化流行，NAFLD 已經(jīng)成為嚴(yán)重危害健康的常見病、多發(fā)病，并已成為我國最常見慢性肝病[12]。然而目前尚無明確的藥物被推薦用于治療NAFLD[3，5]，其治療藥物的研發(fā)依然任重道遠。

桑葚的營養(yǎng)價值和藥用價值較高，含有花青素、黃酮類、多糖、白藜蘆醇、生物堿等生物活性物質(zhì)，具有補肝益腎、滋陰養(yǎng)血和延緩衰老的功效[6]。桑葚可應(yīng)用于多種疾病的防治，如脂質(zhì)代謝紊亂、糖尿病、癌癥、心血管疾病和阿爾茲海默病等[6-7]。

作為肥胖及代謝綜合征的一個組分，NAFLD 的發(fā)生發(fā)展常伴隨著脂質(zhì)代謝的異常（高脂血癥及肝臟脂質(zhì)沉積）[3，5，10]。由于肝臟脂肪的聚積和沉積，使得NAFLD 大鼠的肝臟體積增大、色澤變得灰白，肝臟指數(shù)相應(yīng)降低，肝組織油紅O 染色強陽性提示肝內(nèi)TG 顯著聚積，HE 染色提示肝細胞內(nèi)脂滴空泡和氣球樣變顯著。而桑葚能減輕肝臟脂質(zhì)沉積，使脂滴空泡明顯減少，改善肝脂肪變，并不同程度降低血清TG、TC、LDL-C 水平，升高HDL-C 水平；ALT 及AST水平亦不同程度降低；且桑葚高劑量組降低TG、LDL-C 的作用，低、中劑量組提升HDL-C 的作用優(yōu)于異甘草酸鎂對照組。提示桑葚能夠改善脂質(zhì)代謝，其對心血管疾病的保護亦是該作用的印證[13]。研究表明，桑葚可減輕實驗大鼠肝脂肪變性、動脈內(nèi)膜中層厚度和動脈粥樣硬化病變，認(rèn)為可能與桑葚中花青素（23.75%）、多酚（2.95%）和黃酮類化合物（0.94%）的協(xié)同作用相關(guān)[13]。桑葚改善脂質(zhì)代謝的作用可能是建立在調(diào)節(jié)LDL-C 受體基因表達和LDL-C 清除能力、抑制脂質(zhì)生物合成以及調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的基礎(chǔ)上[14]。

綜上，本實驗結(jié)果表明，桑葚對高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD 大鼠的脂質(zhì)代謝（血脂水平、肝內(nèi)脂質(zhì)沉積、肝脂肪變等）具有良好的改善作用。