不同濃度氧合血紅蛋白對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦血管痙攣的影響

王玉妹，唐思魏，張少蘭，吳蕾，石廣志

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種嚴重威脅患者生命的疾病[1]，遲發(fā)性腦血管痙攣（delayed cerebral vasospasm，DCV）是動脈瘤性SAH患者致殘率和死亡率較高的重要原因[2]。血管造影顯示，高達70%的動脈瘤性SAH患者在出血后會出現(xiàn)腦血管收縮，但只有約50%的患者出現(xiàn)腦血管痙攣癥狀，約20%的患者將繼續(xù)發(fā)展成腦梗死[3]。近年來，很多臨床和動物研究不斷探索DCV的發(fā)生機制，但其確切機制目前尚不清楚，這也使得DCV的預(yù)防和治療成為臨床中的一個重點和難點[4]。

有研究顯示，氧合血紅蛋白（oxyhemoglobin）是引起SAH后DCV的重要因素[5-9]。但目前氧合血紅蛋白對于DCV作用的研究大多是在體外進行，將腦血管分離出來，給予一定濃度的氧合血紅蛋白觀察腦血管痙攣情況，且氧合血紅蛋白對DCV的影響尚不明確。目前多采用枕大池二次注血法制作SAH模型[10]，但是尚缺乏一種能夠在動物體內(nèi)模擬不同濃度氧合血紅蛋白引發(fā)DCV的方法。本研究首次采用自體動、靜脈血模擬不同濃度的氧合血紅蛋白，將動、靜脈血分別注入大鼠枕大池內(nèi)，建立SAH模型，通過觀察基底動脈面積及超微結(jié)構(gòu)變化明確有無DCV。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取成年SD大鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量280～300 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗通過了北京市神經(jīng)外科研究所動物福利倫理委員會的批準（批準號：Z141107002514126）。所有大鼠均飼養(yǎng)在溫度20～25 ℃、相對濕度40%～80%室內(nèi)環(huán)境下，光照及黑暗時間均為12 h，可自由進食飲水。將24只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為三組，動脈血SAH組、靜脈血SAH組和對照組，每組8只。

1.2 SAH模型制作及血氣分析 采用枕大池二次注血法制作SAH模型。將大鼠稱質(zhì)量，用10%水合氯醛溶液（北京化學試劑公司）0.4 mL/100 g進行腹腔麻醉，麻醉后將大鼠仰臥位固定于鼠板上，消毒一側(cè)腹股溝區(qū)，逐層切開皮膚及皮下組織，分離出股動脈及股靜脈，備用。大鼠改為俯臥位，胸前墊高，頭部自然前屈，枕部備皮，沿中線切開枕頂部皮膚及皮下組織、寰枕筋膜，顯露硬膜，經(jīng)枕部寰枕間硬膜處，穿刺枕大池，注射器緩慢回抽，可見清涼腦脊液而無血液，提示手術(shù)成功，抽出0.3 mL的腦脊液。動脈血SAH組自股動脈抽取1 mL動脈血，行血氣分析（測量動脈血氧分壓及氧飽和度）以觀察血氧飽和度；同時，將0.3 mL動脈血在2 min內(nèi)緩慢注入枕大池；靜脈血SAH組自股靜脈抽取1 mL靜脈血，行血氣分析，同時將0.3 mL靜脈血緩慢注入枕大池；對照組向枕大池內(nèi)緩慢注入0.3 mL生理鹽水。注射后將穿刺針眼用骨蠟封閉，縫合皮膚。將大鼠置于30 °頭低位15～30 min，輔助血液在顱內(nèi)基底動脈周圍分布。第一次注射后24 h重復(fù)同樣的操作。所有大鼠腹腔注射10萬U青霉素，持續(xù)3 d。第二次注射結(jié)束后，飼養(yǎng)7 d，可自由進食飲水。

1.3 一般情況及腦組織觀察 每天觀察大鼠的意識狀態(tài)、外觀、運動、飲食狀況等，早晚各記錄一次，同時觀察其是否有神經(jīng)癥狀。飼養(yǎng)7 d后，將大鼠用10%水合氯醛0.6 mL/kg進行腹腔麻醉后，經(jīng)左心室灌注0.9%生理鹽水250 mL后，再灌注4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（北京化學試劑公司）250 mL，灌注完畢后，雙側(cè)前頂枕開顱，在枕骨大孔上方，將含基底動脈的腦、小腦、腦干解剖完整取出，4%多聚甲醛固定24 h后，觀察腦組織標本、基底動脈周圍有無血液凝集。

1.4 HE和免疫熒光染色觀察基底動脈形態(tài)變化 取基底動脈分叉處的動脈，石蠟包埋，切片HE染色，并采用免疫熒光法進行一抗、二抗（北京中杉金橋生物有限公司）染色。在光學顯微鏡（E600，日本尼康公司）下觀察基底動脈的平均管徑面積、管壁的厚度及基底動脈的形態(tài)變化。用圖像采集與分析系統(tǒng)（西德奧伯肯卡爾-蔡司股份有限公司）收集數(shù)據(jù)，記錄每只大鼠基底動脈的平均管徑面積、管壁厚度。

1.5 電鏡下觀察基底動脈的超微結(jié)構(gòu) 取一部分基底動脈進行固定、沖洗，通過光學顯微鏡定位超薄組織切片后，應(yīng)用電子顯微鏡（H-7650，日立）觀察基底動脈的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，兩組比較采用配對t檢驗；多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 動脈血與靜脈血比較 動脈血的氧分壓（94.8±9.8 mm Hgvs41.8±6.5 mm Hg，P＜0.001）和氧飽和度（96.6%±1.7%vs72.4%±8.9%，P＜0.001）明顯高于靜脈血（圖1）。

2.2 各組一般情況及腦組織比較 二次注血后，動脈血SAH組和靜脈血SAH組均出現(xiàn)了一系列的精神神經(jīng)癥狀，如活動及進食減少、體重減輕、對刺激反應(yīng)減弱、困倦，嚴重者甚至出現(xiàn)癱瘓等。對照組無明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀。

肉眼觀察：對照組大鼠腦組織未見蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)有血液，基底動脈及其周圍無血凝塊。動脈血SAH組和靜脈血SAH組解剖標本可見不同程度的粘連和血凝塊殘留，蛛網(wǎng)膜下腔、基底池均可見血凝塊，基底動脈及其分支被血凝塊包裹，腦組織腫脹，腦組織結(jié)構(gòu)無明顯變化（圖2）。

2.3 基底動脈管腔面積及管壁厚度比較 顯微鏡下觀察：對照組基底動脈管徑平滑，組織結(jié)構(gòu)基本正常，管壁無增厚；動脈血SAH組基底動脈管徑變窄，管壁增厚，可見粒細胞、單核細胞浸潤；靜脈血SAH組基底動脈較動脈血SAH組管徑增寬，管壁較薄，血管痙攣較動脈血組不明顯（圖3）。

對照組、靜脈血SAH組、動脈血SAH組基底動脈的管徑面積分別為84 130.27±11 397.9 nm2、68 480.89±12 687.4 nm2、40 816.09±10 410.51 nm2，三組整體比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=28.9，P＜0.001）。與對照組相比，動脈血和靜脈血SAH組管徑面積均明顯變小，基底動脈出現(xiàn)血管痙攣（對照組與動脈血SAH組P=0.039，與靜脈血SAH組P＜0.001）；與靜脈血SAH組相比，動脈血SAH組管徑面積較?。≒＜0.001）。

圖1 動脈血和靜脈血氧分壓和氧飽和度的比較

圖2 三組大鼠SAH后腦組織圖像

對照組、靜脈血SAH組、動脈血SAH組基底動脈的管壁厚度分別為1.84±0.33 μm、2.36±0.25 μm、3.07±0.59 μm，三組整體比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=17.9，P＜0.001）。與對照組相比，動脈血SAH組管壁厚度明顯增加（P＜0.001）；靜脈血SAH組管壁厚度有增加的趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P=0.61）；與靜脈血SAH組相比，動脈血SAH組管壁明顯增厚（P=0.007）（圖4）。

2.4 基底動脈的超微結(jié)構(gòu) 電鏡下觀察：對照組內(nèi)皮細胞及中層平滑肌細胞正常，內(nèi)皮細胞無空泡變性，中層平滑肌細胞厚度正常。動脈血和靜脈血SAH組均出現(xiàn)一些超微結(jié)構(gòu)的改變，平滑肌細胞排列紊亂，均有不同程度的內(nèi)皮細胞空泡變性。與靜脈血SAH組相比，動脈血SAH組內(nèi)皮細胞空泡變性更嚴重，且動脈血SAH組平滑肌細胞排列更加紊亂（圖5）。

圖3 三組大鼠基底動脈的免疫熒光染色圖（光學顯微鏡×20，×40）

圖4 三組大鼠基底動脈的管徑面積及管壁厚度比較

3 討論

SAH是臨床上一種常見的疾病，也是威脅患者生命的一種嚴重疾病，尤其是SAH一旦發(fā)生DCV后，可能引起進一步的缺血損害，出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失，甚至出現(xiàn)腦梗死，導(dǎo)致死亡[11]。影響SAH后DCV的因素很多，如一氧化氮含量、血管內(nèi)皮細胞功能障礙、血液中各種免疫因子水平等[12-13]，其中氧合血紅蛋白是引起SAH后DCV的重要因素。氧合血紅蛋白引起腦血管痙攣的機制可能有：Kv通道抑制[9]，細胞內(nèi)Ca2+水平升高[6]，Rho激酶和（或）蛋白激酶C活性增加，導(dǎo)致Ca2+敏感性增加，降低一氧化氮的有效性和增加血管收縮劑20-HETE合成。

圖5 三組大鼠基底動脈的超微結(jié)構(gòu)圖像（電子顯微鏡×20萬，×40萬）

一項動物研究探索了隨SAH進展氧合血紅蛋白與基底動脈攣縮程度的關(guān)系，該研究發(fā)現(xiàn)基底動脈直徑在SAH后3 d、5 d和7 d分別攣縮了20%、35%和45%；同時，隨著病程進展氧合血紅蛋白含量也逐漸增加[14]，此研究證實了氧合血紅蛋白的含量與腦血管痙攣之間有密切的關(guān)系。2008年，一項體外試驗將基底動脈分離，暴露在氧合血紅蛋白培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)現(xiàn)氧合血紅蛋白能夠引起腦血管痙攣，可能的原因是R型電壓依賴性Ca2+通道的表達，也間接證明了氧合血紅蛋白是DCV的一個重要因素[8]。然而，這些研究均在體外進行，或是間接證明了氧合血紅蛋白在DCV發(fā)生中的重要作用。動、靜脈血最主要的區(qū)別為氧合不同，即氧合血紅蛋白濃度不同，也有研究顯示靜脈血中的氧含量約為動脈血的40%，氧合血紅蛋白含量僅為動脈血的35%～40%[15]，因此，本研究采用自體動、靜脈血模擬不同濃度的氧合血紅蛋白，同時也對動、靜脈血進行了血氣分析，發(fā)現(xiàn)動脈血和靜脈血的氧飽和度分別為96.6%±1.7%和72.4%±8.9%，即血液中被氧結(jié)合的氧合血紅蛋白占全部可結(jié)合血紅蛋白的百分比。采用自體動、靜脈血可以避免異體排斥反應(yīng)，更好地模擬由動脈瘤破裂引起的SAH，啟動炎性反應(yīng)，血管攣縮、血流量降低導(dǎo)致血管痙攣。

本研究采用枕大池二次注血法模擬SAH，第一天向枕大池注入自體血液，24 h后再次注入自體血，造成比較穩(wěn)定的SAH。因血管容易受到應(yīng)激反應(yīng)的影響，實驗結(jié)束后采用心臟灌注處死動物，用多聚甲醛將血液全部置換，盡可能地保持血管原有形態(tài)，減少應(yīng)激反應(yīng)對血管的影響。同時，采用多種方法評估血管攣縮程度，如基底動脈的直徑和管壁厚度；采用免疫熒光法觀察基底動脈痙攣的程度，電子顯微鏡觀察基底動脈血管損傷的超微結(jié)構(gòu)等，保證實驗結(jié)果的嚴謹性。

本研究有一定的局限性，實驗中用血氣分析中的氧分壓和動、靜脈血氧飽和度反映氧合血紅蛋白濃度，未精確測量氧合血紅蛋白和去氧血紅蛋白的含量，但動、靜脈氧飽和度能夠較好地反映氧合血紅蛋白濃度。實驗性SAH與臨床性SAH的特征有很多不同，仍需要進一步研究驗證氧合血紅蛋白在臨床中對DCV的影響。研究中觀察到低濃度的氧合血紅蛋白能夠降低DCV程度，但未進一步研究其病理生理學過程和分子機制。

本研究發(fā)現(xiàn)SAH后DCV的發(fā)生與氧合血紅蛋白濃度密切相關(guān)，降低氧合血紅蛋白濃度可減輕腦血管痙攣程度。但氧合血紅蛋白引起DCV的病理生理學過程和分子機制仍需要進一步研究，明確其根本通路，也許能為DCV的治療靶點提供依據(jù)，從而改善SAH后患者的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。

【點睛】本研究首次采用動脈血和靜脈血模擬不同濃度的氧合血紅蛋白，并用枕大池二次注血法模擬了SAH后DCV的模型，發(fā)現(xiàn)低濃度的氧合血紅蛋白能夠減輕SAH后DCV。