再生障礙性貧血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）診斷價值的臨床研究

劉娜，姜麗波，張淑英，周虹，曲延章，姚宇寧，許玲玲，周暢

齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院血液科，黑龍江齊齊哈爾161000

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種骨髓造血衰竭綜合征，以骨髓造血細胞增生減低和外周血全血細胞減少為特征，在臨床上表現(xiàn)為不同程度的三系血細胞減少所致的貧血、出血和感染等[1-2]。有關(guān)AA的“免疫介導”發(fā)病機制,國內(nèi)外均認為細胞免疫異常在其發(fā)病中起重要作用[3]，因此AA實質(zhì)上是以骨髓組織為靶器官的T細胞免疫異常介導的疾病[4-5]。早期研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞 (regulatory T cell，Tregs）持續(xù)表達在機體免疫抑制反應和免疫耐受狀態(tài)方面起重要作用[6-7]。Foxp3是轉(zhuǎn)錄因子叉頭樣/翼狀螺旋家族成員，是Treg最具有特征性的分子標志，對Treg細胞發(fā)育成熟和功能完善發(fā)揮重要作用，同時在維持免疫耐受中起重要作用[8-9]。因此，目前關(guān)于Treg細胞在AA診斷方面的研究報道很多[10-13]，但是，針對Treg細胞在不同亞群AA之間的分布及差異的報道還不是很多。因此，該研究主要探討2017年1月—2019年1月期間初診的急性再生障礙性貧血（SAA）和慢性再生障礙性貧血（CAA)共40例患者外周血中CD4+、CD25+和Foxp3+Treg細胞亞群變化情況及相關(guān)基因表達情況，評價其在AA診斷中的應用價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取該院血液科收治的初發(fā)AA患者40例，平均年齡（55.42±22.7）歲；男性17例，女性23例。根據(jù)《中國再生障礙性貧血的診斷和治療專家共識》(2017)診斷及分類標準將患者分為CAA患者18例，男8例，女10例。SAA患者22例，男9例，女13例。同時選擇健康體檢20名正常人作為對照組（CN），平均年齡為（58.36±17.2）歲；男8名，女12名。3組一般資料對比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。所有患者知情同意該次研究。

1.2 方法

所有受試者均清晨空腹收集血樣。所有樣本被放置在正常空白采血管內(nèi)4℃條件下儲存2～3 h,然后3 000 r/min離心20 min。收集血清樣本，并在-80℃冷凍后進行進一步檢測。該研究所有受試者均簽署知情同意書并由齊齊哈爾醫(yī)學院倫理委員會批準。

1.3 主要試劑及儀器

熒光標記的抗體：Anti-Human Foxp3 Staining Kit-Alexa Fluor 647,Foxp3(259D/C7),CD4(RPA-T4),CD25(M-A251)，Human Foxp3 Buffer set（BD bioscience公司，USA）；BD FACSCanto II型流式細胞儀(BD公司，USA)；Hitachi 7600自動臨床生化分析儀(Hitachi公司,日本)。PE標記的抗人CD4、PE-Cy5標記的抗人CD25及FITC標記的抗人Foxp3試劑盒(含配套的固定和透膜試劑)均購自EB ioscience公司；淋巴細胞分離液(上海哈靈生物科技有限公司，中國)；RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒(Takara)。Nano Drop 2000分光光度計(Nano Drop Technologies,USA)。Stratagene MX4000TM熒光定量PCR儀（Agilent Technologies,USA）。

1.4 方法

將-80℃凍存的外周血清置于4℃下凍緩后取2 mL加入EDTA抗凝管，充分混勻；準備兩根流式管，標明同型對照管和檢測管，分別用1、2表示；取外周血清100μL分別加入兩管，兩管內(nèi)均加入C D4-FITC/CD25-BC96各20μL，暗室室溫避光孵育30 min后加入稀釋的溶血素和破膜劑，反應后以破膜緩沖液洗滌并重懸，1號管加入I gG-PE 5μL，2號管加入Foxp3-PE 20μL，再次暗室室溫避光孵育30 min；加入5 mL PBS緩沖液沖洗，1 200 r/min離心5 min去上清。加入400μL PBS緩沖液上機檢測。

1.5 FCM檢測

采用BD公司的FACSCantoII型流式細胞儀進行檢測,結(jié)果分析用Cellquest軟件。在FSC-SSC點圖上選定淋巴細胞群,然后分析該群細胞中CD3+T細胞內(nèi)CD4+細胞的表達情況。以CD4+和SSC設(shè)門,選擇CD4+細胞分析其中CD25+和Foxp3表達,并按CD25+表達程度的不同設(shè)門進行分析其中Foxp3細胞所占比例。

1.6 熒光定量PCR檢測

采用Trizol法常規(guī)提取細胞總RNA共10 uL,將提取得到的總RNA使用NanoDrop2000分光光度計（Nano Drop Technologies USA）檢測濃度，分別取各樣品RNA 500 ng進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA（Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）。采 用Ace Q qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme）試劑盒在Stratagene MX4000TM（Agilent Technologies）熒光定量PCR系統(tǒng)上進行熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR的反應條件為：95°C預變性5 min，40個循環(huán)的95°C 10 s和60°C 30 s，最后是95°C 15 s、60°C 1 min和95°C 15 s來獲得溶解曲線。所檢測的各基因及β–ACTIN內(nèi)參的引 物 為CD4-F：ATTG GGCTAGGCATCTTCTT；CD4-R：GGACACTGGCAGGTCTTCTT，CD25-F：AAGGTGCAAAT CAATGCGTAC；CD25-R：CCTCCAT CCCTTCTCCCTCT，F(xiàn)oxp3-F：TTTCTGTCAGTCCACTTCACCA；Foxp3-R：CCAGCAGGTCTGAGGCT TTG，β-ACTIN-F：TGGCACC CAGCACAATGAA；β-ACTIN-R：TAAGTCATAGTCCGCCTAGA AGCA。熒光定量PCR獲得的各基因CT值用于計算相對表達量，計算公式為：相對表達量=2-ΔΔCt。分別測出CD4+、CD25+和Foxp3的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中CD4+,CD4+CD25+和Foxp3+Treg細胞表達水平

SAA及CAA患者外周血中CD4+,CD4+CD25+和Foxp3 Treg細胞流式細胞檢測，可以看出對于CN組，SAA及CAA患者患者Treg細胞比率顯著減少，見圖1；另通過Cellquest軟件計算不同細胞系的細胞占比，相對于CN組，CAA組及SAA組外周血中的上述指標均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這說明AA患者的外周血中CD4+細胞以及Foxp3 Treg細胞的表達均顯著下降；另外，CAA及SAA組之間進行比較時也能看出類似的趨勢，CAA組的Foxp3 Treg細胞檢測值為（2.64±0.48）%，明顯高于SAA組的（1.51±0.34）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時對比CAA組的CD4+以及CD4+CD25+T細胞的表達比率均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組研究對象外周血調(diào)節(jié)性T細胞及Foxp3的表達水平[（±s），%]

表1 3組研究對象外周血調(diào)節(jié)性T細胞及Foxp3的表達水平[（±s），%]

注：與對照組之間比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CAA組之間比較，ΔP＜0.05

組別CD3+CD4+/CD3+CD3+CD4+CD25+/CD3+CD4+CD3+CD4+CD25+Foxp3+/CD3+CD4+CAA組SAA組CN組（33.36±13.87）*（31.61±13.27）**Δ（16.14±4.06）*（13.72±6.63）**Δ（2.64±0.48）**（1.51±0.34）**Δ 52.05±9.42 23.97±5.93 5.05±1.38

圖1 外周血中表達CD4+,CD25+和Foxp3 T淋巴細胞檢測結(jié)果

2.2 外周血中CD4+,CD4+CD25+和Foxp3 Treg細胞mRNA表達情況

SAA及CAA患者外周血中CD4+,CD4+CD25+和Foxp3 Treg細胞的mRNA表達情況，見圖2?？梢钥闯雠cCN組比較，SAA及CAA患者的Treg細胞mRNA表達顯著減少；但與流式細胞檢測結(jié)果不同的是，在CD4+CD25+Treg細胞水平CAA組（0.77±0.28)和SAA組（0.63±0.09）之間統(tǒng)計學比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時，SAA組與CAA組及CN組比較Foxp3 mRAN表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組研究對象外周血調(diào)節(jié)性T細胞及Foxp3 mRNA表達情況（±s）

表2 3組研究對象外周血調(diào)節(jié)性T細胞及Foxp3 mRNA表達情況（±s）

注:與對照組之間比較*P＜0.05，**P＜0.01;與CAA組之間比較：ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01

組別CD4+CD4+CD25+ CD4+CD25+Foxp3+CAA組SAA組CN組（0.83±0.32）**（0.55±0.37）**ΔΔ（0.77±0.28）**（0.63±0.09）**Δ（0.63±0.19）**（0.43±0.11）**ΔΔ 1.03±0.43 1.07±0.17 0.96±0.28

圖2 3組外周血中CD4+、CD4+CD25+和CD4+CD25+Foxp3+mRNA定量PCR檢測表達情況

3 討論

正常人外周血中的全血T淋巴細胞主要包括T輔助/誘導T淋巴細胞亞群（CD4+）和T抑制/細胞毒淋巴細胞亞群（CD8+），其中CD3+CD4+T淋巴細胞在輔助B淋巴細胞免疫應答、調(diào)節(jié)機體自身免疫等方面發(fā)揮著重要作用[14-15]。目前已經(jīng)有足夠的證據(jù)證實AA發(fā)病過程中存在Th淋巴細胞亞群異常[16]，這其中以CD4+T細胞進入骨髓后能夠分泌大量細胞因子并對骨髓干細胞起到破壞作用，是導致骨髓衰竭的主要環(huán)節(jié)[17]。在該研究中，發(fā)現(xiàn)SAA組及CAA組外周血中CD3+CD4+/CD3+比值較健康人顯著降低（P＜0.05），說明AA患者外周血中CD3+CD4+T淋巴細胞減少。早期研究[18]發(fā)現(xiàn)AA患者CD3+CD4+T淋巴細胞減少的同時，CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量增多，導致Th細胞的不同亞群之間的平衡被打破，導致細胞功能亢進，進而也可以抑制造血干細胞的功能，這也是導致骨髓衰竭的原因，因此，這些外周血中T細胞亞群的變化最終會引起患者造血功能障礙的臨床表現(xiàn)。再生障礙性貧血患者不僅具有異常的T細胞數(shù)量，而且在T細胞的分布，表型和功能方面也有顯著變化。CD4+CD25+Treg細胞是在未活化的CD4+T細胞中新發(fā)現(xiàn)的T細胞亞群，具有免疫抑制性和免疫無能性。石秀珍等人[19]通過對46例AA患者與正常對照組比較，AA組外周血CD4+CD25+Treg細胞明顯降低（t=2.738，P＜0.01），且SAA組低于CAA組（t=1.986，P＜0.01）。同時進行CD4+CD25+Treg和T細胞亞群免疫狀態(tài)檢測，陽性率分別為71.7%和60.9%，得出前者免疫狀態(tài)異常的敏感性高于后者（χ2＝4.290，P＜0.05)。僅依靠T細胞亞群來反應AA患者的免疫紊亂尚不全面和準確。在監(jiān)測AA患者免疫功能異常、評估病情及免疫抑制劑療效時，CD4+CD25+Treg細胞優(yōu)于經(jīng)典T細胞亞群。該研究的實驗顯示AA患者CD4+CD25+T細胞的表達比率均明顯低于CN組(P＜0.05)，且SAA組（13.72±6.63）%低于CAA組（16.14±4.06）%（P＜0.05），同石秀珍等[19]研究結(jié)果。AA患者CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量減 少 和 或 其 遷移功能、免疫抑制功能等受損，免疫抑制和免疫監(jiān)視作用減弱，導致自身效應性T細胞過度活化增殖或不能抑制效應性T細胞功能[20]。Foxp3是Treg最具有特征性的分子標志，在AA的發(fā)病機制中起到重要作用。該研究中Foxp3 mRAN檢測與流式細胞中Foxp3表達比率檢測的結(jié)果相一致，均為SAA組與CAA組和CN組比較表達下降，且SAA組低于CAA組。與流式細胞檢測中不一致的是下降差異更明顯(P＜0.01)。表明Foxp3 Treg細胞在AA患者中作為檢測指標更敏感，且疾病嚴重程度導致了更低的Foxp3Treg細胞檢測數(shù)值。該研究的結(jié)果說明AA患者T細胞亞群及調(diào)節(jié)性T細胞受損，SAA患者比CAA患者受損程度嚴重。這與徐金格等[21]研究顯示AA患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及Foxp3在CD4+CD25+T細胞表達百分比明顯比正常人降低的結(jié)果相同。因此，CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比率能夠作為一項指標來評估AA的嚴重程度。

Treg細胞主要通過細胞間接觸途徑殺傷細胞毒性細胞，抑制細胞毒性細胞產(chǎn)生白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子，以及分泌抑制性細胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）這3種途徑發(fā)揮免疫耐受和免疫抑制作用[22]，當Treg細胞疫抑制功能降低時，對自身免疫性T細胞活化增殖的抑制能力降低，異常激活效應性T淋巴細胞，發(fā)生自身免疫應答，影響造血細胞的生成，導致骨髓造血功能衰竭[23]。另外，Zou L等[24]發(fā)現(xiàn)骨髓是Treg細胞重要的儲存池，Treg通過基質(zhì)細胞衍生因子-1α/趨化因子受體CXCR4通路即SDF-1α/CXCR4信號通路遷徙至骨髓，從而發(fā)揮Treg細胞調(diào)控效應T細胞的機制。因此當AA患者的骨髓功能減退時，會間接導致Treg細胞功能障礙，進一步誘導并加重T細胞介導的自身免疫反應，加重AA患者的骨髓衰竭癥狀。在該研究中，發(fā)現(xiàn)SAA患者與CAA患者比較外周血中Treg細胞比值顯著減少,且SAA患者的Treg細胞減少的程度要重于CAA，這說明在AA患者體內(nèi)Treg細胞受損情況明顯，且可反應疾病的嚴重程度；另外，實時定量PCR結(jié)果顯示相應的Foxp3 mRNA基因表達與流式細胞結(jié)果得到類似趨勢，也能夠證實這一結(jié)果。

綜上所述。盡管該研究還存在入選病例不足，但是該研究結(jié)顯示AA患者外周血中CD4+CD25+和CD4+CD25+Foxp3+顯著下降的結(jié)果說明了AA患者在發(fā)病過程中存在明確的Th淋巴細胞亞群異常，Treg調(diào)節(jié)T細胞系統(tǒng)受損。而SAA組的Treg細胞低于CAA組說明Treg細胞下降能夠作為指標來幫助評估臨床疾病的嚴重程度。