miR-520c-3p靶向Rab22a抑制肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的研究*

白帥 楊露瑤 屈揚(yáng) 李慧

2020年全球肺癌新發(fā)病例約220萬，是全球發(fā)病率排名第二位的惡性腫瘤，為導(dǎo)致癌癥死亡的首要原因，約占癌癥總死亡人數(shù)的18%（約180萬例）［1］。肺腺癌是肺癌最常見的病理類型［2］。早期肺癌多無明顯癥狀，患者確診時(shí)多已屬晚期，5年生存率低。MicroRNAs（miRNAs）是一類長度約為18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，主要通過與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結(jié)合，降解或抑制其翻譯，從而參與細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡等方面的調(diào)控［3］。在腫瘤中異常表達(dá)的miRNA可以發(fā)揮抑癌或促癌的作用［4］。如miR-21在肺癌中高表達(dá)，并可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［5］，而miR-202和miR-27b可以抑制腫瘤的發(fā)展［6-7］。有報(bào)道m(xù)iR-520c-3p可以在乳腺癌和肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用［8-9］，但在肺癌中的作用仍未明確。本研究旨在通過檢測肺腺癌組織和細(xì)胞中miR-520c-3p的表達(dá)、生物學(xué)功能及靶基因，為肺腺癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 本研究共納入肺腺癌患者118例，標(biāo)本來源于2010年2月至2015年1月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤生物樣本庫。患者病理學(xué)診斷明確。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。腫瘤組織及癌旁正常組織樣本的基本信息見表1。

表1 118例肺腺癌患者及癌旁正常組織樣本的基本信息

1.1.2 細(xì)胞與主要試劑 肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI-1640 購自美國Gibco公司；Trizol和LipofectamineTM2000購自美國In?vitrogen 公司；引物（miRNA-520c-3p、U6、Rab22a、GAPDH、雙熒光素酶報(bào)告基因載體Rab22a 野生型及突變型）由上海生工公司合成；miRNA-520c-3p模擬物和陰性對(duì)照（miRNA-NC）購自廣州銳博公司；逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自日本Takara 公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑購自美國Promega公司；Rab22a、GAPDH 抗體購自美國Abcam 公司。倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。電泳槽、轉(zhuǎn)移槽購于美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549。培養(yǎng)條件為：5%CO2、恒溫37℃。依據(jù)LipofectamineTM2000 說明書，進(jìn)行miR-520c-3p 模擬物、陰性對(duì)照、Rab22a過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

1.2.2 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析 使用TRIzol 試劑提取總RNA，并溶于無RNA 酶的DEPC水中。合格樣品保存于-80℃冰箱。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用特異性引物，進(jìn)行RT-qPCR檢測。引物序列見表2。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃、30 s；PCR循環(huán)95℃、5 s，60℃、34 s，循環(huán)40次；結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)72℃、30 s。采用RT-qPCR 檢測miR-520c-3p的表達(dá)水平，并以U6為內(nèi)參，通過比較Ct 值法（2-ΔΔCt）進(jìn)行定量分析。其中ΔΔCt 樣本=ΔCt樣本-ΔCt內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將Rab22a 3'UTR野生型（WT）和突變型（Mut）序列與psiCHECK-2載體質(zhì)粒連接，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。將Rab22a DNA片段插入pcDNA3載體中以獲得Rab22a過表達(dá)質(zhì)粒。依據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書，將熒光素酶載體與miR-520c-3p模擬物或陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。48 h后，使用檢測試劑測定熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 引物序列

表2 引物序列（續(xù)表2）

1.2.4 Western blot 檢測 使用RIPA 裂解液提取蛋白，后于10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)至PVDF 膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。4℃一抗孵育過夜。室溫二抗孵育1 h。ECL發(fā)光試劑顯影。GAPDH作為對(duì)照。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 1）侵襲實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞懸液加入涂有Matrigel 膠的上室。下室加入胎牛血清作為趨化因子。2）遷移實(shí)驗(yàn)：上層小室中無Matrigel 膠。37℃培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定。結(jié)晶紫染色。去除上層小室的細(xì)胞。在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 使用TargetScan、miRTar?Base 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因。通過clusterPro?filer軟件包進(jìn)行KEGG分析。

1.2.7 隨訪 采用電話聯(lián)系的方式進(jìn)行隨訪，分析患者疾病進(jìn)展情況。全部病例隨訪至2015年2月，中位隨訪時(shí)間為37（21.25～54.00）個(gè)月。失訪10例，隨訪率為91.53%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)評(píng)估相關(guān)性。使用Kaplan-Meier 法分析患者的生存預(yù)后。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-520c-3p在肺腺癌組織中的表達(dá)

收集118例肺腺癌組織標(biāo)本，檢測miR-520c-3p的表達(dá)水平。結(jié)果顯示在不同分期的肺癌組織中，miR-520c-3p的表達(dá)量低于癌旁組織（P＜0.000 1，圖1A）。通過生存分析發(fā)現(xiàn)，盡管miR-520c-3p高表達(dá)組與低表達(dá)組間無病生存期（disease-free survival，DFS）無顯著性差異（P=0.822，圖1B），但在臨床Ⅰ期的患者中，高表達(dá)miR-520c-3p的患者DFS明顯長于低表達(dá)組（P=0.033，圖1C）。以上結(jié)果表明miR-520c-3p在肺腺癌組織中低表達(dá)，并且高表達(dá)提示患者預(yù)后更好。

2.2 miR-520c-3p抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲

在人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中過表達(dá)miR-520c-3p，通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測對(duì)細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。結(jié)果提示，miR-520c-3p過表達(dá)組的A549細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組（圖2A），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（遷移，P＜0.001；侵襲，P＜0.001，圖2B）。提示miR-520c-3p可以抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

圖1 miR-520c-3p的表達(dá)水平及與預(yù)后的關(guān)系

圖2 miR-520c-3p抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

2.3 生物信息分析對(duì)miR-520c-3p的預(yù)測

通過TargetScan、miRTarBase 和miRDB 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定87個(gè)候選基因（圖3A）。進(jìn)一步KEGG 分析提示，候選基因集中于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路（圖3B）。因此，提示與此信號(hào)通路密切相關(guān)的Rab22a 可能是miR-520c-3p調(diào)控的靶基因。

2.4 肺腺癌組織及細(xì)胞系中miR-520c-3p 和Rab22a mRNA的相對(duì)表達(dá)量

檢測118 例肺腺癌組織樣本中miR-520c-3p 和Rab22a mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，肺腺癌患者miR-520c-3p 與Rab22a mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)（圖4A）。A549 細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染miR-520c-3p mimics 與陰性對(duì)照后，采用Western blot檢測Rab22a蛋白質(zhì)水平（圖4B），發(fā)現(xiàn)在miR-520c-3p 過表達(dá)組，Rab22a 表達(dá)降低比陰性對(duì)照組降低顯著，進(jìn)一步提示miR-520c-3p 與Rab22a可能存在調(diào)控關(guān)系。

2.5 Rab22a是miR-520c-3p的直接靶基因

基于生物信息學(xué)分析，構(gòu)建野生型或突變型Rab22a-3'UTR序列（圖4C）。基于此序列的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型Rab22a-3'UTR雙熒光素酶報(bào)告載體與miR-520c-3p mimics共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（圖4D），提示miR-520c-3p可以直接結(jié)合Rab22a-3'UTR，即Rab22a是miR-520c-3p的直接靶基因。

2.6 miR-520c-3p靶向Rab22a抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

采用挽救（rescue）實(shí)驗(yàn)，將pcDNA3-Rab22a過表達(dá)質(zhì)?；騪cDNA3空載質(zhì)粒與miR-520c-3p mimics共轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞。Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Rab22a過表達(dá)可以抵消miR-520c-3p對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制作用（圖5），表明miR-520c-3p是通過抑制Rab22a的表達(dá)，從而抑制肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。

圖3 生物信息分析對(duì)miR-520c-3p的預(yù)測

圖4 肺腺癌組織及細(xì)胞系中miR-520c-3p和Rab22a mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖5 miR-520c-3p靶向Rab22a抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

3 討論

MicroRNAs（miRNAs）是一類長度約為18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA。哺乳動(dòng)物中，miRNA 首先由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)miRNA（pri-miR?NA）。隨后由細(xì)胞核內(nèi)的Drosha/DGCR8復(fù)合物加工成前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA 被Expor?tin5-Ran-GTP 復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，并被Dicer 酶與dsRBP蛋白剪切為雙鏈miRNA。雙鏈miRNA被轉(zhuǎn)載進(jìn)AGO2，形成RISC（RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體）參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。雙鏈中的一條鏈保存在RISC 復(fù)合物中，另一條鏈則被迅速降解。在腫瘤細(xì)胞中，miRNA 是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要組成部分，可以通過調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、生長、凋亡、轉(zhuǎn)移等方式發(fā)揮促癌或抑癌的作用［10］。如miR-520 家族在多種腫瘤中異常表達(dá)并發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-520c-3p 可以通過抑制靶基因Rab22a從而抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲的能力。有報(bào)道m(xù)iR-520c-3p 在不同腫瘤中發(fā)揮不同的功能。如miR-520c-3p在纖維肉瘤、前列腺癌和胃癌中發(fā)揮促癌的作用，但在結(jié)腸癌和肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用［9，11］。在肺癌中，有研究報(bào)道m(xù)iR-520c-3p在腫瘤組織中低表達(dá)，并可通過靶向轉(zhuǎn)錄因子Yin Yang 1（YY1）抑制腫瘤的生長，但miR-520c-3p對(duì)肺腺癌患者生存的影響尚未明確［11］。

本研究通過RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn)，miR-520c-3p在腫瘤組織中低表達(dá)，并且高表達(dá)提示預(yù)后更好。此外，miR-520c-3p可以抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲的能力。為進(jìn)一步明確miR-520c-3p的作用機(jī)制，本研究首先進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果提示Rab22a可能為miR-520c-3p的靶基因。

Rab22a 是Ras 超家族中的一員，在內(nèi)吞作用、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞骨架形成等方面均發(fā)揮重要作用［12］。已有報(bào)道Rab22a在結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤、胃癌中高表達(dá)，并發(fā)揮促癌作用［13-15］。Rab22a 是樹突狀細(xì)胞內(nèi)MHC-Ⅰ類分子轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白，因此也是有效抗原提呈的重要保證［16］。此外，Rab22a 在肺癌中可以通過調(diào)節(jié)CD147 的膜定位，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲［17］。但是，Rab22a 與非編碼RNA 之間的調(diào)控關(guān)系并未明確。本研究通過RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn)Rab22a與miR-520c-3p的表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)。隨后，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)miR-520c-3p 可直接調(diào)控Rab22a。進(jìn)一步的挽救實(shí)驗(yàn)表明，Rab22a 過表達(dá)可以抵消miR-520c-3p 對(duì)細(xì)胞遷移浸潤能力的抑制作用。因此，miR-520c-3p 通過直接抑制Rab22a 的表達(dá)，進(jìn)而抑制了肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。

目前，多種miRNA 已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。如澳大利亞已開展miR-16類似物對(duì)惡性胸膜間皮瘤或非小細(xì)胞肺癌患者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，并且初步結(jié)果較積極。miR-34 類似物已于2013年進(jìn)入一項(xiàng)多中心Ⅰ期臨床試驗(yàn)，用于包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的治療，但因受試者出現(xiàn)嚴(yán)重免疫相關(guān)不良反應(yīng)而被終止。此外，miR-22 已進(jìn)入多中心的Ⅱa 期臨床試驗(yàn)，用于丙型肝炎的治療。目前，臨床應(yīng)用的困難在于篩選出腫瘤特異性的miRNA，并保證其有效性和安全性［18］。因此，要解決此難點(diǎn)，就需要對(duì)miRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-520c-3p通過直接靶向負(fù)調(diào)控Rab22a，抑制了肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，高表達(dá)miR-520c-3p的臨床Ⅰ期肺腺癌患者的預(yù)后更佳。因此，miR-520c-3p是肺腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。