欖香烯對(duì)腫瘤惡病質(zhì)小鼠細(xì)胞因子TNF-ɑ IL-6和骨骼肌UPP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用*

尹愛(ài)凝 李宏林 姚娓

腫瘤惡病質(zhì)（cancer cachexia，CC）是腫瘤患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，其主要表現(xiàn)為不可逆的體質(zhì)量下降，伴隨骨骼肌萎縮。腫瘤惡病質(zhì)的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤患者的體質(zhì)量下降超過(guò)5%、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）＜20 kg/m2的患者體重下降超過(guò)2%［1］。據(jù)估計(jì)，在病程后期，60%～80%的腫瘤患者會(huì)有惡病質(zhì)的表現(xiàn)［2］，至少20%腫瘤患者的直接死亡原因是腫瘤引起的惡病質(zhì)［3］。骨骼肌萎縮是腫瘤惡病質(zhì)的核心癥狀，骨骼肌質(zhì)量下降和腫瘤患者生存質(zhì)量下降明顯相關(guān)［4］，體質(zhì)量下降，低肌肉質(zhì)量是腫瘤患者預(yù)后不佳的標(biāo)志，其與總的體重?zé)o關(guān)［5］，減輕骨骼肌萎縮是腫瘤惡病質(zhì)的重要治療目標(biāo)。欖香烯是中藥莪術(shù)的有效活性成分，具有明顯的抗癌活性，可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以抑制腫瘤細(xì)胞增殖［6-7］，但目前關(guān)于欖香烯對(duì)腫瘤惡病質(zhì)是否有治療效果鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)構(gòu)建腫瘤惡病質(zhì)小鼠模型，檢測(cè)欖香烯對(duì)腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的保護(hù)作用以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與動(dòng)物 小鼠Lewis 肺腺癌腫瘤細(xì)胞（Lewis lung cancer，LLC），由上海富恒公司提供；健康雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠40 只，9 周齡，體重（22±2）g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（合格證號(hào)SYXK（遼）2018-0007）。

1.1.2 藥物 醋酸甲地孕酮為甲地孕酮純單體粉末，美國(guó)Aladdin公司生產(chǎn)，用蒸餾水配置成濃度為4 mg/mL懸濁液。欖香烯口服乳，批號(hào)：H20010338，由大連華立金港藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。置于4℃冰箱備用。

1.1.3 主要試劑及儀器 兔來(lái)源一抗MAFBx、MURF-1、β-actin 及二抗均購(gòu)于中國(guó)ABclonal 公司，Western blot 相關(guān)試劑盒購(gòu)于中國(guó)Solarbio 公司，白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購(gòu)于武漢云克隆公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基將LLC 細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液，2～3天進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠造模 將LLC細(xì)胞接種于10 cm平皿，擴(kuò)增至80%融合后收集細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞成單個(gè)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，PBS溶液將LLC細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/mL，予小鼠右前腋背部皮下接種LLC細(xì)胞懸濁液0.2 mL，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，第12 天時(shí)，肉眼已可見(jiàn)到小鼠右側(cè)脅肋部腫瘤，小鼠體重和飲食量出現(xiàn)明顯下降，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)提示小鼠進(jìn)入惡病質(zhì)狀態(tài)［8］，說(shuō)明荷瘤模型已建立，開始進(jìn)行藥物治療。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 40 只小鼠，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將其分為健康組、惡病質(zhì)模型組、醋酸甲地孕酮組、欖香烯組，每組10只。健康組和惡病質(zhì)模型組小鼠分別給予生理鹽水0.2 mL/只灌胃；醋酸甲地孕酮組給予醋酸甲地孕酮溶液0.2 mL/只灌胃（給藥劑量以160 mg/kg 計(jì)，用生理鹽水稀釋，濃度4 mg/mL）；欖香烯組給予欖香烯口服乳0.2 mL/只灌胃（給藥劑量以60 mL/kg計(jì)，將欖香烯口服乳用生理鹽水稀釋1.67倍。每天1 次，連續(xù)給藥2 周。第14 天后，眼眶取血后處死小鼠，完整剝離皮下移植瘤、腓腸肌及脛骨前肌，完整摘取肝臟。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 1）飲食量、腫瘤重量、去瘤體重、腓腸肌加脛骨前肌總重量和肝臟重量。在治療過(guò)程中，每天記錄小鼠的飲食量。給藥14天后，處死小鼠剝離皮下移植瘤，稱量小鼠的瘤重及去瘤體重。完整分離腓腸肌及脛骨前肌，并稱量其重量。完整摘除肝臟，濾紙吸取表面液體，稱取重量，計(jì)算肝臟重量占去瘤體重的百分比。

2）HE 染色觀察腓腸肌肌絲橫截面積形態(tài)學(xué)變化。分離小鼠腓腸肌后，放入4%多聚甲醛固定。將小鼠腓腸肌依次放入梯度酒精（75%乙醇、80%乙醇、95%濃度乙醇、無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ）進(jìn)行脫水，之后放入二甲苯對(duì)脫水后的組織進(jìn)行透明，用石蠟包埋機(jī)將肌肉組織進(jìn)行包埋。包埋結(jié)束后進(jìn)行切片、烤片、脫蠟，進(jìn)行蘇木伊紅染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腓腸肌肌絲橫截面積，并使用Image J 軟件進(jìn)行分析。

3）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)IL-6 和TNF-ɑ含量。小鼠眼眶取血后，室溫避光靜置1～2 h，4℃離心，2 500 r/min，30 min，取上清，-80℃保存。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（OD）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清樣本中TNF-α和IL-6的含量。

4）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)肌肉環(huán)狀指基因（muscle ring finger 1，MURF-1）、肌肉萎縮盒F基因（muscle atrophy F-box，MAFbx）蛋白表達(dá)。取凍存的小鼠腓腸肌組織，提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，將樣品蛋白濃度調(diào)整到均一值，制備蛋白樣品。配制10%SDS-PAGE 分離膠，每個(gè)泳道上樣蛋白50 μg，將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔單克隆抗體MAFBx（1:1 500）、MURF1（1:1 500）、β-actin（1:5 000）4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜后，羊抗兔二抗（1:5 000）室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。條帶密度使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異分析采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用（）表示，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的腫瘤重量、去瘤體重、腓腸肌加脛骨前肌總重量比較

在給藥過(guò)程中，健康組、惡病質(zhì)模型組和欖香烯組小鼠各出現(xiàn)1 只死亡。欖香烯組小鼠的腫瘤重量低于惡病質(zhì)模型組和醋酸甲地孕酮組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相對(duì)于健康組，惡病質(zhì)模型組小鼠的去瘤體重及腓腸肌加脛骨前肌總重量顯著下降（P＜0.05），出現(xiàn)了毛發(fā)粗糙、活動(dòng)量少等惡病質(zhì)表現(xiàn)；欖香烯組小鼠的去瘤體重、腓腸肌加脛骨前肌總重量較醋酸甲地孕酮組和惡病質(zhì)模型組小鼠均有所上升，較惡病質(zhì)模型組上升顯著（P＜0.05，表1）。

表1 各組小鼠腫瘤重量及去瘤體重、腓腸肌加脛骨前肌總重量 （±s）

表1 各組小鼠腫瘤重量及去瘤體重、腓腸肌加脛骨前肌總重量 （±s）

#：與健康組比較，P＜0.05；*：與惡病質(zhì)模型組比較，P＜0.05

分組健康組惡病質(zhì)模型組甲地孕酮組欖香烯組小鼠只數(shù)（只）9 9 1 0 9腫瘤重量（g）-4.50±1.51 3.74±2.18 3.68±2.24去瘤體重（g）29.15±0.87 26.69±1.06#27.23±1.15#27.57±1.03#腓腸肌加脛骨前肌總重量（mg）678.2±32.0 558.4±42.6#576.6±37.5#606.8±41.9#*

2.2 各組小鼠腓腸肌肌絲橫截面積比較

健康組小鼠腓腸肌肌絲橫截面積大且較為均勻。相對(duì)于健康組，惡病質(zhì)模型組、醋酸甲地孕酮組、欖香烯組小鼠肌絲橫截面積均有不同程度的縮?。≒＜0.05）；欖香烯組小鼠肌絲橫截面積相對(duì)于惡病質(zhì)模型組有較大升高，且高于醋酸甲地孕酮組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表2）。

表2 各組小鼠的腓腸肌肌絲橫截面積 （±s）

表2 各組小鼠的腓腸肌肌絲橫截面積 （±s）

#：與健康組比較，P＜0.05；*：與惡病質(zhì)模型組比較，P＜0.05；$：與醋酸甲地孕酮組比較，P＜0.05

分組健康組惡病質(zhì)模型組醋酸甲地孕酮組欖香烯組腓腸肌橫截面積（μm2）2 658.41±143.20 1 873.81±291.25#1 943.53±301.87#2 284.98±180.26#*$

2.3 各組小鼠的飲食量及肝臟重量占去瘤體重的比例比較

與健康組相比，惡病質(zhì)模型組小鼠的飲食量明顯下降（P＜0.05），但其肝臟重量占去瘤體重的百分比明顯上升（P＜0.05）；醋酸甲地孕酮組小鼠的飲食量明顯增加，甚至高于健康組，其肝臟重量占去瘤體重的百分比高于惡病質(zhì)模型組（P＜0.05）；欖香烯組小鼠的飲食量和惡病質(zhì)模型組相近，其肝臟重量占去瘤體重的百分比較惡病質(zhì)模型組和甲地孕酮組均有所減少（P＜0.05，表3）。

表3 各組小鼠的飲食量及肝臟重量占去瘤體重的百分比（±s）

表3 各組小鼠的飲食量及肝臟重量占去瘤體重的百分比（±s）

#：與健康組比較，P＜0.05；*：與惡病質(zhì)模型組比較，P＜0.05；$：與醋酸甲地孕酮組比較，P＜0.05

分組健康組惡病質(zhì)模型組醋酸甲地孕酮組欖香烯組飲食量（g）3.42±0.15 2.91±0.20#3.53±0.29*3.02±0.25#肝臟重量占去瘤體重（%）5.62±0.12 6.55±0.18#7.10±0.42#*6.11±0.23#*$

2.4 小鼠血清IL-6和TNF-α含量

惡病質(zhì)模型組、醋酸甲地孕酮組和欖香烯組小鼠血清IL-6 和TNF-α 含量較健康組明顯升高（P＜0.05）；欖香烯組小鼠血清IL-6和TNF-α含量相對(duì)于惡病質(zhì)模型組和醋酸甲地孕酮組明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表4，圖1）。

表4 各組小鼠血清細(xì)胞因子IL-6和TNF-α含量 （±s）

表4 各組小鼠血清細(xì)胞因子IL-6和TNF-α含量 （±s）

#：與健康組比較，P＜0.05；*：與惡病質(zhì)模型組比較，P＜0.05；$：與醋酸甲地孕酮組比較，P＜0.05

分組健康組惡病質(zhì)模型組醋酸甲地孕酮組欖香烯組IL-6（ng/L）43.58±4.33 162.23±19.63#159.45±19.71#117.83±15.37#*$TNF-α（ng/L）68.29±7.51 125.56±14.59#116.23±13.57#93.69±9.20#*$

圖1 各組小鼠血清IL-6和TNF-ɑ表達(dá)水平

2.5 小鼠腓腸肌組織中MAFBx、MURF-1 蛋白表達(dá)水平

相對(duì)于健康組，惡病質(zhì)模型組小鼠的腓腸肌中MAFBx、MURF-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；醋酸甲地孕酮組小鼠腓腸肌組織中的MAFBx蛋白表達(dá)水平略高于惡病質(zhì)模型組，而其MURF-1蛋白表達(dá)水平較惡病質(zhì)模型組降低；欖香烯組腓腸肌中MAF?Bx、MURF-1蛋白表達(dá)水平相對(duì)于惡病質(zhì)模型組和甲地孕酮組有一定程度下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠腓腸肌的MAFBx、MURF-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

腫瘤惡病質(zhì)是腫瘤患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，骨骼肌萎縮是腫瘤惡病質(zhì)的核心癥狀。本研究在治療過(guò)程中，因灌胃操作不當(dāng)，健康組小鼠出現(xiàn)1只死亡；惡病質(zhì)模型組和欖香烯組小鼠在疾病治療后期，因腫瘤生長(zhǎng)速度過(guò)快，小鼠的飲食及呼吸受到明顯抑制，各出現(xiàn)1只死亡。給藥結(jié)束時(shí)，各組小鼠樣本量為9例或10例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果表明，欖香烯組小鼠腫瘤重量低于惡病質(zhì)模型組及醋酸甲地孕酮組，欖香烯組小鼠的去瘤體重和腓腸肌加脛骨前肌總重量相對(duì)于惡病質(zhì)模型組有一定程度上升，且高于醋酸甲地孕酮組；同時(shí)欖香烯組腓腸肌肌絲橫截面積相對(duì)于惡病質(zhì)模型組及醋酸甲地孕酮組明顯升高，提示欖香烯緩解腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮效果優(yōu)于醋酸甲地孕酮。

腫瘤惡病質(zhì)是一種慢性消耗性疾病，厭食引起的能量攝入減少與異常代謝引起的能量消耗增加導(dǎo)致腫瘤患者負(fù)向的能量平衡，是導(dǎo)致腫瘤惡病質(zhì)的直接原因［9-10］。本研究中，惡病質(zhì)模型組小鼠的飲食量相對(duì)于健康組顯著下降，惡病質(zhì)模型組小鼠的能量攝入減少。研究發(fā)現(xiàn)，醋酸甲地孕酮作為一種食欲刺激藥，可增加癌癥患者的體質(zhì)量、提高食欲，但其具有增加死亡、水腫、呼吸困難和深靜脈血栓形成等不良反應(yīng)［11-12］。本研究結(jié)果顯示，醋酸甲地孕酮能明顯增加腫瘤惡病質(zhì)小鼠的飲食量，其飲食量甚至高于健康組，而欖香烯在增加腫瘤惡病質(zhì)小鼠的飲食攝入量方面低于醋酸甲地孕酮。在能量消耗方面，人體能量消耗包括靜息能量消耗、活動(dòng)能量消耗和飲食生熱，占人體總的能量消耗的比例分別為60%：75%，20%：30%和10%［13］，靜息能量消耗是人體能量消耗的主要成分［14-15］。肝臟、大腦、心臟、腎臟占人體體質(zhì)量的7%，占人體靜息能量代謝的58%，是高代謝器官；而骨骼肌占人體體質(zhì)量的50%，僅占人體靜息能量代謝的22%，為低代謝組織［13，16-17］。肝臟是小鼠重量最大的器官，惡病質(zhì)患者肝重量的增加與能量消耗增加及線粒體解耦聯(lián)蛋白表達(dá)有關(guān)［18］，肝臟重量占去瘤體重的百分比升高則小鼠的能量消耗增加。有研究表明，雖然腫瘤惡病質(zhì)小鼠的體重是下降的，但惡病質(zhì)小鼠的肝臟重量是上升的［19-21］。本研究結(jié)果也表明，惡病質(zhì)模型組小鼠肝臟重量占去瘤體重的百分比明顯升高，導(dǎo)致小鼠的能量消耗增加，但醋酸甲地孕酮組小鼠肝臟百分比較惡病質(zhì)模型組明顯上升，可能與其增加小鼠的能量消耗有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究，而欖香烯組小鼠肝臟重量占去瘤體重的百分比較惡病質(zhì)模型組和醋酸甲地孕酮組均有下降，說(shuō)明欖香烯組小鼠能量消耗減少，欖香烯能夠改善惡病質(zhì)小鼠的能量平衡。

在腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的過(guò)程中，細(xì)胞因子TNF-α與IL-6發(fā)揮了重要作用。有報(bào)道顯示，TNF-α和IL-6在內(nèi)的幾種炎性細(xì)胞因子直接影響患者的食欲和代謝，并誘發(fā)癌癥相關(guān)的惡病質(zhì)綜合癥［22-23］。TNF-α 結(jié)合肌肉細(xì)胞表面的TNF 受體，通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)MURF-1 和MAFbx 等蛋白的表達(dá)，激活泛素-蛋白酶體（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）途徑進(jìn)而降解肌肉蛋白［23］。Cai等［24］研究證明，TNF-α、IL-6能夠激活NF-κB通路，進(jìn)入細(xì)胞核引起UPP因子的轉(zhuǎn)錄，加強(qiáng)UPP信號(hào)通路的表達(dá)。TNF-α及IL-6 等炎癥因子升高能導(dǎo)致厭食，激活骨骼肌蛋白降解，抑制蛋白合成，增強(qiáng)全身的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加劇惡病質(zhì)的進(jìn)程［25］。因此，TNF-α 和IL-6 水平的升高是癌癥惡病質(zhì)中骨骼肌消耗的重要原因。本研究中，欖香烯組小鼠血清IL-6 及TNF-α 水平較惡病質(zhì)模型組及醋酸甲地孕酮組明顯下降，說(shuō)明欖香烯在降低小鼠TNF-α及IL-6水平方面優(yōu)于醋酸甲地孕酮，證明欖香烯緩解惡病質(zhì)小鼠骨骼肌萎縮效果優(yōu)于醋酸甲地孕酮。

肌肉萎縮是由于骨骼肌中蛋白質(zhì)合成減少和蛋白質(zhì)分解增加所致［26］。已確定UPP信號(hào)通路是惡病質(zhì)狀態(tài)下骨骼肌萎縮的重要通路［27-28］，其能夠降解肌纖維和大部分可溶性蛋白，MURF-1和MAFbx是UPP信號(hào)通路的限速酶，MURF-1和MAFbx可以降解粗肌絲的肌球蛋白重鏈等成分［29］，MURF-1也能降解細(xì)肌絲中的肌鈣蛋白Ⅰ和肌動(dòng)蛋白等有關(guān)成分［30-31］。有研究表明，MURF-1和MAFbx的表達(dá)增強(qiáng)能夠促進(jìn)底物蛋白的泛素化，從而使更多的蛋白轉(zhuǎn)移至蛋白酶體中進(jìn)行降解，加重骨骼肌的萎縮［32-33］，此外，觀察到缺乏MAFbx 或MURF-1 基因的大鼠對(duì)肌萎縮具有抵抗性［34］。研究數(shù)據(jù)表明，惡病質(zhì)模型組小鼠腓腸肌MURF-1和MAFbx蛋白表達(dá)水平明顯高于健康組；欖香烯組小鼠腓腸肌MURF-1和MAFbx蛋白表達(dá)水平相對(duì)于惡病質(zhì)模型組和醋酸甲地孕酮組有一定程度的降低。因此推測(cè)欖香烯可通過(guò)降低小鼠腓腸肌泛素-蛋白酶體途徑活性，抑制小鼠肌肉組織蛋白的分解代謝，進(jìn)而減輕惡病質(zhì)小鼠骨骼肌萎縮。

欖香烯有效緩解腫瘤惡病質(zhì)的骨骼肌萎縮，其機(jī)制與降低機(jī)體能量消耗，緩解能量失衡，抑制細(xì)胞因子TNF-α 及IL-6 的表達(dá)，降低骨骼肌MAFBx 及MURF1 的蛋白表達(dá)水平，調(diào)節(jié)UPP 信號(hào)通路的活性有關(guān)。此結(jié)果為腫瘤惡病質(zhì)進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究提供新的思路，為臨床使用欖香烯治療腫瘤惡病質(zhì)提供理論依據(jù)。

腫瘤惡病質(zhì)是一種多因素綜合征，其發(fā)病原因極為復(fù)雜，目前大部分研究結(jié)果多為動(dòng)物試驗(yàn)，臨床證據(jù)較少，因此關(guān)于欖香烯緩解腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的效果，需要進(jìn)一步臨床試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。