釀酒酵母中基于外殼蛋白復(fù)合物Ⅱ囊泡的蛋白分泌調(diào)控機制的研究進展

董曉敏，劉延峰，劉 龍，堵國成*，李江華

(1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

在真核細胞中，分泌途徑對于蛋白質(zhì)的分泌以及定位在質(zhì)膜、高爾基體和溶酶體上的蛋白質(zhì)的運輸是必不可少的。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的分泌依靠的是經(jīng)典的ER(Endoplasmic Reticulum)-Golgi分泌途徑：帶有信號肽序列的mRNA在胞質(zhì)中翻譯為多肽；在信號肽的作用下進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行折疊與修飾；成熟的蛋白被包裹進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面生成的COPⅡ囊泡，運輸至高爾基體，進一步加工修飾，而后分類進入不同目的地，包括細胞器、質(zhì)膜或者外排至細胞外。其中COPⅡ囊泡介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體蛋白質(zhì)運輸是分泌途徑中至關(guān)重要的第一步。COPⅡ囊泡形成的組成成分及運輸過程受到的調(diào)控在不同物種間都非常保守。對釀酒酵母中COPⅡ囊泡運輸整個過程中受到的調(diào)控機制的研究進展進行綜述。

1 COPⅡ囊泡的結(jié)構(gòu)

早在1994年，釀酒酵母中COPⅡ外殼蛋白的核心組分就已經(jīng)被鑒定完全，其外殼包含5個亞基：Sar1、Sec23/Sec24和Sec13/Sec31。其中Sar1是GTP酶開關(guān)蛋白中的一種，當(dāng)其與GDP結(jié)合時處于“關(guān)閉”狀態(tài)，與GTP結(jié)合時處于“開啟”狀態(tài)。開啟狀態(tài)的Sar1-GTP結(jié)合異二聚體Sec23/Sec24組成涂層的內(nèi)層，兩個亞基Sec13和Sec31組裝成的異四聚體組成涂層的外殼。多個外殼蛋白聚合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外層時，可將包裹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜擠壓成球形囊泡，并在囊泡中包裹貨物蛋白，隨后脫離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，開始蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運。因此，外殼蛋白復(fù)合物Ⅱ(COPⅡ)主要執(zhí)行兩個主要功能：將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜變形為球形囊泡，并在囊泡中填充特定的貨物,COPⅡ囊泡結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

圖1 COPⅡ囊泡結(jié)構(gòu)示意圖(修改[6])

2 COPⅡ囊泡的形成

COPⅡ囊泡轉(zhuǎn)運貨物的整個過程大致分為4個步驟：形成、出芽、束縛和融合，形成和出芽之間沒有嚴(yán)格的時間區(qū)分。形成過程也可分為3個階段：(1)組裝，5個亞基依次組裝到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，同時識別成熟且具有特定識別序列的貨物蛋白；(2)成熟，組裝位點區(qū)域的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜開始彎曲；(3)出芽，成熟的囊泡從膜上脫離。

2.1 COPⅡ組裝機制

(1)COPⅡ組裝順序。COPⅡ外殼的組裝是由膜錨定的鳥嘌呤核苷酸交換因子(Guanine Nucleotide Exchange Factors, GEF)Sec12激活小GTP酶Sar1啟動。首先，在Sec12催化作用下，游離在胞質(zhì)中無活性的Sar1-GDP轉(zhuǎn)為有活性的Sar1-GTP形式，并定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。膜上的Sar1-GTP與Sec23亞基結(jié)合，募集Sec23/Sec24異二聚體，形成內(nèi)層復(fù)合物，并通過Sec24捕獲內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的貨物蛋白形成“預(yù)萌芽復(fù)合物”。亞基Sec23通過與Sec31的脯氨酸富集區(qū)域相互作用，進一步募集到外涂層復(fù)合物Sec13/Sec31四聚體，內(nèi)層和外層聚合形成籠狀結(jié)構(gòu)。

通過分析釀酒酵母中Sar1-Sec12復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)部分地揭示COPⅡ組裝的激活機制，即Sec12中的β-螺旋GEF域與其跨膜結(jié)構(gòu)域之間僅有10個氨基酸殘基，使得GEF結(jié)構(gòu)域與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面的距離較短，且Sec12的表面帶正電荷。這些保證了β-螺旋GEF域與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面可以直接相互作用，該作用使得Sar1與Sec12的β-螺旋結(jié)合時，Sar1的N端區(qū)域也被指向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。當(dāng)Sar1進一步與GTP結(jié)合時，Sar1蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，其N端兩親性α-螺旋暴露出來，以合適的位置插入膜中，同時與Sec12解離。這種機制可以有效地提高Sar1-GTP靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的效率。

(2)COPⅡ組裝位點。COPⅡ外殼蛋白的組裝發(fā)生在稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口位點(ER Exit Sites，ERES)的膜區(qū)域，該區(qū)域沒有核糖體。釀酒酵母中的ERES幾乎遍布整個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，小而多，看似隨機分布，實際上可能主要集中位于由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白Rtn1、Rtn2和Yop1誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜高曲率區(qū)域。推測可能的機制有兩個，一種是COPⅡ衣殼內(nèi)層預(yù)萌復(fù)合物Sar1-Sec23/Sec24自身的結(jié)構(gòu)偏好性，可以識別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特定高曲率區(qū)域。還有一種可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的高曲率區(qū)域富集的小管結(jié)構(gòu)域更有利于被激活的Sar1的N端兩親性α-螺旋插入膜中。有研究報道與低曲率膜相比，具有高曲率的膜表面Sar1的GTP酶活性較高，而Sar1兩親性α-螺旋通過部分埋在脂質(zhì)雙層面上，取代膜上的脂質(zhì)頭基，引起膜不對稱的擴展使得膜彎曲，因此推測Sar1的GTP酶活性和膜曲率之間存在正反饋作用。

2.2 COPⅡ組裝受調(diào)控機制

在釀酒酵母中，COPⅡ囊泡在生成的過程中處于一種動態(tài)亞穩(wěn)定狀態(tài)，這是由于COPⅡ外殼的組裝受到涂層自身組分和組分之外的蛋白調(diào)控因子的多種作用控制。

已知COPⅡ外殼蛋白的組裝是由小GTP酶Sar1結(jié)合GTP后驅(qū)動，而亞基Sec23是Sar1的GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein，GAP)，后者會催化Sar1的GTP水解。在外殼早期組裝的過程中Sec23與活性形式的Sar1結(jié)合時，Sec23的胍鹽側(cè)鏈與磷酸基團接觸，從而催化Sar1-GTP水解為無活性形式的Sar1-GDP，導(dǎo)致內(nèi)層復(fù)合物的分解。在外殼蛋白晚期組裝的過程中，Sec23受到Sec31的刺激后，GAP活性顯著提高并加速GTP的水解。那么在囊泡形成的過程中，細胞自身如何抵抗由于Sar1的GTP水解帶來的涂層去穩(wěn)定作用，存在哪些調(diào)控機制可以保證涂層組件的穩(wěn)定性，并使得COPⅡ涂層在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上聚合持續(xù)一段足夠生成囊泡的時間，推測有以下4種原因：

(1)在Sar1-GTP水解后，通過Sec24亞基與跨膜貨物蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的相互作用，使得Sec23/Sec24仍可以穩(wěn)定地結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，該機制延長了衣殼內(nèi)部涂層保留在膜上的時間。這樣的觀點也支持了在COPⅡ囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜剝離之前Sar1可能就從膜上解離的研究，即當(dāng)COPⅡ衣殼的完整結(jié)構(gòu)在膜上形成后，就不再需要活性形式的Sar1來維持COPⅡ衣殼在膜上的締合。由于只有與Sec24貨物適配器直接或間接結(jié)合的蛋白才能起到穩(wěn)定內(nèi)部涂層的作用，因此該機制還有利于COPⅡ囊泡有效地分選到正確的貨物蛋白。

(2)內(nèi)層復(fù)合物和外層復(fù)合物之間的相互作用，如Sec23和Sec31之間的多界面作用有助于涂層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

(3)錨定在內(nèi)質(zhì)膜上的Sec12具有高且穩(wěn)定的GEF活性，可以不斷地催化新Sar1-GTP的生成，并插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與新生芽的邊界之間，從而增加衣殼的穩(wěn)定性。

(4)外殼蛋白組分之外的調(diào)控因子參與COPⅡ衣殼的組裝過程。其中研究最多的是Sec16蛋白。Sec16蛋白是一種大的多結(jié)構(gòu)域蛋白，與COPⅡ衣殼的多個亞基相互作用。當(dāng)Sec16蛋白結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜時，參與調(diào)節(jié)Sar1的GTP酶活性來介導(dǎo)COPⅡ衣殼的組裝。有研究表明這種調(diào)節(jié)是由于Sec16蛋白的C末端保守區(qū)域與Sec23和Sar1的關(guān)聯(lián)作用，間接地阻礙了Sec31針對Sec23的GAP活性能力的激活。已知的是Sec16與Sec23的相互作用不會直接影響Sec23本身的GAP活性，僅僅是干擾了Sec31對Sec23的GAP激活作用。還有研究表明，亞基Sec24與Sec16的締合產(chǎn)生的復(fù)合物也可以間接調(diào)控Sec16對GTP水解的負調(diào)控作用。因此，Sec16蛋白具有抑制Sar1的GTP水解，從而穩(wěn)定COPⅡ的涂層結(jié)構(gòu)，對COPⅡ囊泡的周轉(zhuǎn)率起到負調(diào)控的作用。此外，在釀酒酵母中，Sec16也被認(rèn)為具有充當(dāng)ERES上支架招募COPⅡ外殼蛋白的功能。

2.3 COPⅡ囊泡捕獲蛋白質(zhì)機制

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的成熟蛋白質(zhì)進入COPⅡ囊泡主要通過兩種方式。選擇性捕獲是其中研究的較為清楚的一種攝取方式，某些成熟的貨物蛋白通過直接或間接結(jié)合COPⅡ外殼的貨運銜接蛋白Sec24亞基，被選擇性濃縮進入囊泡，因此貨物蛋白在囊泡中的濃度比內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的高。在酵母中，通過進入COPⅡ囊泡的方式離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白有近800多種，選擇性捕獲機制如何實現(xiàn)其對不同種蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合呢？已知貨物蛋白和Sec24亞基之間的相互作用是由Sec24表面的結(jié)合位點介導(dǎo)的，目前研究發(fā)現(xiàn)Sec24亞基上至少有4個獨立的裝載位點，每個裝載位點可以識別不同的分揀信號，因此可以識別不同的貨物蛋白。釀酒酵母中還存在兩個Sec24亞基旁系同源物(Iss1和Lst1)，均可以與Sec23形成貨物銜接子復(fù)合體，且具有不同的貨物識別特異性。例如，有研究表明Iss1可能專門用于包裝v-SNARE蛋白。在正常生長狀態(tài)下，Sec24表達量最高，其次是Lst1，表達量最低的是Lss1。而且這3個貨物銜接亞基在每個ERES位點的分布不同，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)時，它們的分布又改變?yōu)橄鄬鶆虻碾S機分布，該機制表明胞內(nèi)環(huán)境的變化能夠控制ERES的裝載。除此之外，不同的Sec24同工型還會影響囊泡的結(jié)構(gòu)，有Lst1參與的囊泡尺寸約為87 nm，而普通囊泡尺寸約為60 nm。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔還存在某些不能直接與Sec24相互作用的貨物蛋白，需通過與貨物受體蛋白的作用間接與Sec24結(jié)合，這些貨物受體蛋白具有廣泛性，促進了蛋白質(zhì)的分選。綜合以上兩個因素，COPⅡ囊泡可以實現(xiàn)幾百種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運。由于目前貨物蛋白的大多數(shù)結(jié)構(gòu)信息來自與包含分類信號的合成肽結(jié)合的外殼蛋白的共晶體，所以單個Sec24分子一次可以結(jié)合多少個不同的分類信號還不清楚。已知的是Sec24識別的分類信號既包括簡單的氨基酸基序(如DxE、LxxLE和YxxNPF)，也包含折疊的表位。

第二種方法是成熟的蛋白以“整體流”或者“散裝物流”的方式非選擇性地進入COPⅡ囊泡。與經(jīng)歷選擇性濃縮進入囊泡的貨物蛋白不同，這些蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的濃度與囊泡中的濃度相當(dāng)。該類成熟蛋白質(zhì)往往與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶以及其他質(zhì)量控制組件之間無相互作用，且與外殼蛋白也無相互作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的駐留蛋白和未成熟的蛋白質(zhì)無法被選擇性捕獲系統(tǒng)識別，因此不會通過選擇性攝取方式輕易地離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。同時，這些蛋白通過與固定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)相互作用，降低其隨著整體流擴散到囊泡中的可能性。最新的研究表明，COPⅡ囊泡的存在還有助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白的保存。這些機制保證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口的高度選擇性。

2.4 COPⅡ囊泡的成熟和出芽

在COPⅡ組裝的過程中，外殼蛋白裝配時形成的籠狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的曲率賦予球形囊泡形成的膜彎曲力。涂層之間自聚合形成低聚物后產(chǎn)生的力足夠去克服膜中脂質(zhì)雙層的固有剛性，囊泡形成球形隨后COPⅡ囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面剝離。在先前的報道中可知，Sar1的N末端α-螺旋的插入對于囊泡分離非常重要。也有學(xué)者指出，COPⅡ囊泡的出芽獨立于Sar1的GTP水解活性。因此，到目前為止COPⅡ囊泡出芽的機制仍尚未完全揭示。

最新研究表明在正常生長的釀酒酵母細胞中通過電子顯微鏡中的COPⅡ囊泡數(shù)量較少，并分析是由于在囊泡釋放前，以分散的形式存在細胞質(zhì)中的順式高爾基體可以通過所謂的“擁抱和親吻”形式與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出口位點接觸，兩者之間暫時形成功能單元，順式高爾基體就直接捕獲內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的貨物。這種方式比COPⅡ囊泡釋放到細胞質(zhì)中后再與高爾基體膜表面接觸的方式更安全和有效，但是多數(shù)實驗表明COPⅡ囊泡出芽后會離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，進入下一個運輸步驟。

3 COPⅡ囊泡束縛和融合機制

3.1 COPⅡ囊泡束縛

囊泡與靶膜的初始相互作用是由稱為系鏈或者束縛因子介導(dǎo)的。在釀酒酵母中，介導(dǎo)COPⅡ囊泡的束縛因子為定位于高爾基體膜上的多亞基轉(zhuǎn)運蛋白顆粒I(TRAPPI)，包含7個亞基(Bet5p、Bet3p、Trs20p、Trs23p、Trs31p、Trs33p和Trs85p)。一方面，TRAPPI充當(dāng)募集和激活小GTP酶Ypt1的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)，在高爾基體受體膜表面產(chǎn)生活化的Ypt1-GTP。Ypt1-GTP招募具有螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域的Uso1蛋白，Uso1隨后可能與供體囊泡上存在的卷曲系留因子接觸，在COPⅡ囊泡和高爾基膜之間建立長距離的連接。而且TRAPPI的亞基Bet5、Trs23和Trs31與Ypt1之間的相互作用進一步穩(wěn)定Ypt1-GTP形式。隨后，TRAPPI的亞基Bet3可以直接與COPⅡ衣殼的Sec23亞基結(jié)合，將囊泡引導(dǎo)至更靠近膜的近端位置。TRAPPI復(fù)合物中包含兩個拷貝的Bet3亞基，所以單個的TRAPPI復(fù)合物可以同時結(jié)合兩個COPⅡ囊泡。因此，在束縛因子與Rab GTP酶、外殼蛋白等組分相互作用下，將COPⅡ囊泡準(zhǔn)確地系留到高爾基體膜上。囊泡束縛過程示意圖如圖2所示。

圖2 囊泡束縛過程示意圖(修改[51])

3.2 受SNARE蛋白介導(dǎo)的膜融合機制

系留的囊泡與順式高爾基體膜的融合依靠的是可溶的N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體蛋白(SNARE)。SNARE是一類Ⅱ型膜蛋白，根據(jù)錨定的位置不同，位于轉(zhuǎn)運囊泡上的SNARE稱為v-SNARE，是在囊泡形成過程中被選擇性移至囊泡膜。位于囊泡特定結(jié)合的受體膜上的稱為t-SNARE。除了C末端錨定在膜上外，SNARE還包括一段約50～70個氨基酸的α-螺旋基序。根據(jù)基序中心結(jié)構(gòu)的不同，又將SNARE分為兩類，其中基序中心是精氨酸殘基的為R-SNARE，是谷氨酰胺殘基的為Q-SNARE。按照序列保守性，Q-SNARE進一步細分為Qa、Qb和Qc-SNARE。膜之間的融合一般需要4個同源的SNARE蛋白，且在囊泡膜上的v-SNARE為R-SNARE，受體膜上的t-SNARE則通常是由一條重鏈和兩條輕鏈的Qa、Qb和Qc-SNARE組成。當(dāng)囊泡系留在靶膜后，v-SNARE和t-SNARE即可通過電荷互補作用結(jié)合成穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)，形成SNARE復(fù)合體。SNARE復(fù)合體在組裝的過程中通過釋放能量去克服由于膜之間對立的磷脂頭基團產(chǎn)生的阻礙，因此可以直接驅(qū)動囊泡膜與供體膜融合。在酵母中，COPⅡ囊泡在與順面高爾基體膜表面融合時，Sec22充當(dāng)R-SNARE，Sed5p充當(dāng)Qa-SNARE，Bos1p充當(dāng)Qb-SNARE，Bet1p充當(dāng)Qc-SNARE。膜的特異性融合除了基于這4個SNARE蛋白的同源性外，還依賴于Sec1/Munt18-1(SM)系列結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)。Sly1是SM的家族成員之一，直接結(jié)合Sed5并增加SNARE復(fù)合物的保真度，是COPⅡ囊泡與高爾基體膜融合所必需的蛋白。膜融合后，完成蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運，隨后SNARE復(fù)合物被Sec18p分解。

4 總結(jié)

近些年來通過系列深入研究，科學(xué)家們已部分揭示了COPⅡ囊泡組裝的基本步驟及運輸過程受到的調(diào)控，但仍存在很多不完全清晰的機制，例如囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上分離的確切時間點還不清楚；外殼復(fù)合物的多個亞基存在磷酸化修飾，這些修飾對囊泡的調(diào)控機理了解不完整；對COPⅡ囊泡的裝載物以及販運通量受到的動態(tài)調(diào)節(jié)還需進行深入研究。因此，未來還需要結(jié)合無細胞實驗、活細胞監(jiān)測等技術(shù)以進一步明確整個囊泡運輸機制。