健脾消癌方對(duì)缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響及抑癌機(jī)制研究

宋琳　張利　蔣益蘭

〔摘要〕 目的 研究健脾消癌方對(duì)缺氧微環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討其抑癌機(jī)制。方法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞隨機(jī)分為健脾消癌方組（10%健脾消癌方的含藥血清培養(yǎng)）和對(duì)照組（10%的空白血清培養(yǎng)），兩組同時(shí)在缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d。采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)兩組結(jié)腸癌細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9、Survivin mRNA及蛋白的表達(dá);MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖;Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 與對(duì)照組比較，健脾消癌方組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞HIF-1α、VEGF、Bcl-2 mRNA和蛋白水平降低（P<0.05），Caspase-3 mRNA和蛋白水平升高（P<0.05）;健脾消癌方組結(jié)腸癌SW620細(xì)胞在48、72、96 h時(shí)細(xì)胞存活率降低（P<0.01），遷移和穿透室膜細(xì)胞數(shù)降低（P<0.05），細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。結(jié)論 健脾消癌方能下調(diào)缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細(xì)胞HIF-1α水平，間接影響其下游靶基因的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減弱細(xì)胞的遷移，發(fā)揮抗癌作用。

〔關(guān)鍵詞〕 結(jié)腸癌;健脾消癌方;缺氧;低氧誘導(dǎo)因子-1α;生物學(xué)行為;抑癌機(jī)制

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.010

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of Jianpi Xiaoai Formula on the biological behavior of colon cancer cells in hypoxic microenvironment and to explore its possible mechanism. Methods SW620 colon cancer cells in logarithmic growth phase were randomly divided into the Jianpi Xiaoai Formula group （cultured with 10% Jianpi Xiaoai Formula serum） and the control group （cultured with 10% blank serum）， both groups were induced and cultured in hypoxic environment for 14 days at the same time. Real-time PCR and Western blot were used to detect the expressions of hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α）， VEGF，Bcl-2， Caspase-3， MMP-9， Survivin mRNA in colon cancer cells of the two groups; MTT was used to detect cell proliferation; transwell was used to detect cell migration and invasion ability; flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Results Compared with the control group， the mRNA and protein levels of HIF-1α， VEGF and Bcl-2 in SW620 colon cancer cells of the Jianpi Xiaoai Formula group decreased （P<0.05）， Caspase-3 increased （P<0.05）; the survival rate of SW620 colon cancer cells decreased at 48， 72 and 96 hours （P<0.01）， the number of migrating and penetrating ependymal cells decreased （P<0.05）， and the cells apoptotic rate increased （P<0.05） in the Jianpi Xiaoai Formula group. Conclusion Jianpi Xiaoai Formula can down-regulate the expression of HIF-1α in colon cancer cells in hypoxic microenvironment， indirectly affect the expression of its downstream target genes， inhibit the proliferation of colon cancer cells， promote cell apoptosis， reduce cell migration， so as to play an anti-cancer role.

〔Keywords〕 colon cancer; Jianpi Xiaoai Formula; hypoxia; hypoxia inducible factor-1α; biological behavior; anti-cancer mechanism

結(jié)腸癌是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高居惡性腫瘤的第三位，根據(jù)中國(guó)癌癥中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率占全球24.3%，死亡率占全球22.9%，并且呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，結(jié)腸癌治療主要為手術(shù)輔以放化療、基因治療及分子靶向治療等，其5年總體生存率仍不及50%[2]，結(jié)腸癌已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的一類(lèi)疾病。因此，研究結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)控分子以及揭示侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)結(jié)腸癌的防治具有重要的理論價(jià)值。研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與腫瘤所處的微環(huán)境密切相關(guān)。由于惡性腫瘤異常的血管形成以及腫瘤細(xì)胞無(wú)限制的生長(zhǎng)導(dǎo)致微環(huán)境中氧含量降低，即缺氧微環(huán)境。缺氧條件下可導(dǎo)致低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）的積累，腫瘤細(xì)胞在HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下適應(yīng)低氧環(huán)境，并且通過(guò)激活靶基因使其在腫瘤發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3-4]，導(dǎo)致腫瘤常規(guī)治療預(yù)后較差。因此，研究HIF-1α信號(hào)通道與腫瘤之間的關(guān)系尤為重要。

中醫(yī)藥具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，可有效改善腫瘤微環(huán)境，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡、抑制誘導(dǎo)腫瘤基因表達(dá)和癌癥細(xì)胞遷移[5]。本課題組前期臨床研究[6-7]表明，健脾消癌方治療晚期結(jié)直腸癌能穩(wěn)定瘤體、有效降低腫瘤標(biāo)志物、提高患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)腸癌患者中位無(wú)進(jìn)展生存期和中位總生存時(shí)間。

本文從分子生物學(xué)層面探討健脾消癌方對(duì)結(jié)腸癌的抗癌機(jī)制，研究在缺氧微環(huán)境下健脾消癌方對(duì)SW620結(jié)腸癌細(xì)胞HIF-1α水平及下游靶基因VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9、Survivin的影響，揭示其在缺氧微環(huán)境下的抗癌機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物及細(xì)胞系

SPF級(jí)SD大鼠10只，1.5～2個(gè)月齡，體質(zhì)量（200±20） g，雌雄各半，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-005。結(jié)腸癌SW620細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所（批號(hào)2018051233577），用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（內(nèi)含10%小牛血清，1%鏈青霉素），在CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。缺氧誘導(dǎo)條件：37 ℃，5% CO2，94% N2，培養(yǎng)14 d。

1.2? 藥物

健脾消癌方（甘草3 g，炒枳殼6 g，莪術(shù)10 g，法半夏10 g，黨參15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，淫羊藿15 g，郁金15 g，黃芪20 g，薏苡仁30 g，半枝蓮30 g，靈芝30 g，重樓30 g，白花蛇舌草30 g）飲片符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[8]規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院。將以上所有藥按5倍量處方，加8倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，過(guò)濾;再加6倍量水，煎煮1 h，過(guò)濾，合并兩次濾液靜置24 h，12 000 r /min離心15 min后將上清液濃縮至850 mL，4 ℃冷藏48 h，離心冷藏液得到約800 mL上清，滅菌后制成含生藥2.1 g/mL的水煎劑備用。

1.3? 主要試劑及儀器

胎牛血清（批號(hào)：P160704）、二甲亞楓（批號(hào)：35605-5G-F）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胰酶消化液（批號(hào)：824300）、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液（批號(hào)：SA166734）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;青霉素（批號(hào)：25465787）、鏈霉素（批號(hào)：5465687）、乙醇（批號(hào)：8754187）購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán);DEPC、MTT試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNA提取試劑盒（批號(hào)：SA1022，AB218110，AB23356）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司;SYBR GREEN試劑盒（批號(hào)：P160704，ST728）、Western blot一抗（批號(hào)：ab78334）購(gòu)自美國(guó)ABI公司;Western blot二抗（南京建成生物科技研究所，批號(hào)：ab189075）;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司，批號(hào)：ab489075）;Transwell小室（批號(hào)：ab889075）（美國(guó)康寧公司）。CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;Multiskan 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（德國(guó)Thermo公司）;QuantStudioTM 6 Flex熒光定量PCR系統(tǒng)（美國(guó)ABI公司）;PowerPAC凝膠電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.4? 健脾消癌方含藥血清制備

參考文獻(xiàn)[9]方法制備健脾消癌方藥物和空白血清，SD 大鼠10只，雌雄各半，隨機(jī)分成 2 組，每組5只。健脾消癌方組大鼠灌胃健脾消癌方[10.8 g/kg，相當(dāng)于70 kg成年人等效量（120 g/d）]，對(duì)照組按大鼠體質(zhì)量灌胃等容積的生理鹽水。每日1次，連續(xù)6 d，于第7天末次灌胃1 h后，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃保存，24 h內(nèi)離心（2 000 r/min，10 min），吸取血清，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5? 細(xì)胞分組與處理

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞用胰酶消化后，按1∶3擴(kuò)大到2個(gè)培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。將2個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和健脾消癌方組，其中對(duì)照組細(xì)胞用缺氧環(huán)境誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，同時(shí)用10%的空白血清培養(yǎng)，健脾消癌方組細(xì)胞用缺氧環(huán)境誘導(dǎo)14 d，同時(shí)用含10%健脾消癌方的血清培養(yǎng)。

1.6? 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1? Real-time PCR法檢測(cè)HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9及Survivin mRNA水平? 收集細(xì)胞，Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)并合成HIF-1、VEGF、Survivin、MMP-9、Bcl-2、Caspase-3及GAPDH定量引物，引物序列見(jiàn)表1。

1.6.2? Western blot法檢測(cè)HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9及Survivin蛋白表達(dá)水平? 用胰酶消化并收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞系。BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性。取30 μg 蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%（M/V）脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h;用TBST洗膜3次后，加入用TBST按1∶500稀釋的一抗，置于搖床4 ℃冰箱過(guò)夜;用TBST洗膜3次，每次5 min;將二抗用TBST按1∶1 000稀釋后室溫與膜接觸，孵育2 h后，TBST洗膜3次;加ECL顯影劑，用自動(dòng)凝膠成像分析儀檢測(cè)，用凝膠成像處理系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)條帶的分子量和光密度值做處理分析。

1.6.3? MTT法檢測(cè)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖活性? 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞隨機(jī)分為健脾消癌方組和對(duì)照組，給予相應(yīng)干預(yù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度按4×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)12 h。兩組各孔均分別加入含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)67 h后，取出96孔板，每孔中加入MTT試劑20 μL，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育4 h。小心吸出各孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上避光孵育20 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD）值，以對(duì)照組OD值為參數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6.4? Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞遷移? 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌SW620細(xì)胞調(diào)整濃度后按4×105/孔接種于6孔板，隨機(jī)分為健脾消癌方組和對(duì)照組。將細(xì)胞換成不完全培養(yǎng)液饑餓12 h，胰酶消化吸收細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌3次，用不完全DMEM培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞調(diào)整密度為106/mL，在每孔上室加入150 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 10% DMEM完全培養(yǎng)液，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱48 h后，從培養(yǎng)板中取出Transwell小室，吸出液體，PBS緩沖液洗滌小室3遍后，加入無(wú)水乙醇，放置30 min。將小室反扣于吸水紙上，室溫干燥基底膜，用結(jié)晶紫染色10 min，流水漂洗3遍，于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞并拍照，Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)值，結(jié)果以細(xì)胞數(shù)表示。

1.6.5? 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡? 取Falcon管分為健脾消癌方組和對(duì)照組，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞用0.25%胰酶消化，離心收集后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，加1×緩沖液制成1×106/mL細(xì)胞懸液;每個(gè)Falcon管中加入100 μL細(xì)胞懸液，樣本管同時(shí)加入AV-FITC和PI染料，同步設(shè)立陰性管（不加任何熒光抗體）和兩只單陽(yáng)管（分別加入AV-FITC和PI染料）震蕩混勻后室溫避光孵育20 min。用1×緩沖液洗滌細(xì)胞1次，棄上清;用100 μL 1×緩沖液溶解0.5 μg Sav-FITC加入Falcon管中，混勻。加入5 μL PI，室溫避光孵育15 min。各管依次加入1×Binding緩沖液400 μL，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 兩組HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9及Survivin mRNA表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，健脾消癌方組HIF-1α、VEGF及Bcl-2 mRNA表達(dá)降低（P<0.05），Caspase-3 mRNA表達(dá)升高（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2? 兩組HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9及Survivin蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，健脾消癌方組HIF-1α、VEGF及Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P<0.05），Caspase-3蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3? 兩組SW620細(xì)胞存活率比較

第0、24、48、72和96時(shí)，健脾消癌方組結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率分別為（99%±1%），（107%±2%），（101%±4%），（89%±5%）和（78%±6%），對(duì)照組結(jié)腸癌細(xì)胞存活率分別為（100%±1%），（112%±2%），（148%±8%），（179%±4%）和（203%±6%）。與對(duì)照組比較，健脾消癌方組第48、72、96小時(shí)SW620細(xì)胞存活率降低（P<0.01）。見(jiàn)圖3。

2.4? 兩組SW620細(xì)胞遷移能力比較

倒置顯微鏡下可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目較多，大小均一，分布均勻，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，折光性較好，增殖較快;而健脾消癌方組細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞間連接減少，培養(yǎng)液中可見(jiàn)漂浮的細(xì)胞碎片，細(xì)胞形態(tài)呈皺縮、變小。結(jié)果顯示健脾消癌方組遷移和穿透室膜的結(jié)腸癌細(xì)胞數(shù)為（72.8±4.3），對(duì)照組為（92.3±4.1），與對(duì)照組比較，健脾消癌方組遷移和穿透室膜的結(jié)腸癌細(xì)胞數(shù)降低（P<0.05）。見(jiàn)圖4-5。

2.5? 兩組SW620細(xì)胞細(xì)胞凋亡率比較

健脾消癌方組結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率（16.22%± 1.07%），高于對(duì)照組（5.17%±0.56%）（P<0.05）。見(jiàn)圖6。

3 討論

《素問(wèn)·評(píng)熱病論》曰：“邪之所湊，其氣必虛”。《素問(wèn)·六微旨大論》曰：“物之生從于化，物之極由乎變”，論述了陰陽(yáng)轉(zhuǎn)化之極致?tīng)顟B(tài)。由此，機(jī)體產(chǎn)生腫瘤之原因在于環(huán)境之變化導(dǎo)致陰陽(yáng)格拒而成，包括內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境，中醫(yī)腫瘤辨證論治的實(shí)質(zhì)就是干預(yù)腫瘤微環(huán)境[10]。

缺氧是實(shí)體瘤客觀存在的微環(huán)境，貫穿與腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。研究表明，腫瘤細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中不但能繼續(xù)存活，還能通過(guò)一系列機(jī)制繼續(xù)生長(zhǎng)、逃脫缺氧應(yīng)急損傷，調(diào)控血管生長(zhǎng)、能量代謝等使自身適應(yīng)缺氧環(huán)境，這在腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展中扮演重要角色[11-13]。HIF-1α是一種缺氧環(huán)境中誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)入細(xì)胞核與特定啟動(dòng)子的反應(yīng)元件結(jié)合后，能調(diào)控上百種靶基因的表達(dá)，從而對(duì)細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境起調(diào)控作用，其中包括VEGF[14]、MMP-9[15]、Survivin[16]、Caspase-3[17]、Bcl-2[18]等。VEGF是已知最強(qiáng)的血管滲透劑，能提高血管尤其是微小血管的通透能力，為瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和毛細(xì)血管網(wǎng)建立提供物質(zhì)支持，對(duì)于預(yù)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后等有重要意義[14]。MMPs是一類(lèi)Zn2+、Ca2+依賴性內(nèi)肽酶家族，能降解并破壞細(xì)胞外基質(zhì)或基膜，MMPs能調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成等[15]。Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族中分子量最小的成員，定位于人類(lèi)染色體17q25上，由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成，它能通過(guò)蛋白酶依賴途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡[16]。Caspase是一類(lèi)在線粒體途徑的細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著極其重要的作用的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的作用下結(jié)合特異輔因子后激活，進(jìn)而激活下游效應(yīng)型Caspase，通過(guò)裂解特異性底物及激活內(nèi)源性核酸酶，最終使細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)和生化特征，發(fā)生不可逆的死亡[17]。Caspase和Survivin之間關(guān)系密切，Survivin是一種多功能蛋白，能通過(guò)Caspase蛋白酶依賴途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡[19]。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其家族成員間通過(guò)精準(zhǔn)的平衡調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，Bcl-2基因及其編碼的蛋白能抑制細(xì)胞凋亡，因此又稱為凋亡抑制基因[18]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，結(jié)腸癌多由于“虛”“毒”“瘀”相互作用、相互影響而形成。健脾消癌方是湖南名醫(yī)蔣益蘭教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)以“益氣健脾，化瘀解毒”為法創(chuàng)制而成，健脾消癌方以黨參、薏苡仁益氣健脾，以健生化之源，而療諸虛不足，從而扶正固本;郁金、莪術(shù)活血化瘀，白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒、散結(jié)消癰，全方配伍攻補(bǔ)兼施，共奏益氣健脾，化瘀解毒之功。健脾消癌方在降低結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，延長(zhǎng)生存期，改善晚期結(jié)腸癌患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量、穩(wěn)定瘤體、調(diào)節(jié)免疫因子CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[7，20]。并且前期實(shí)驗(yàn)也通過(guò)TGF-β/LncRNA-ATB/miR-200a信號(hào)通路[21]及Wnt/β-catenin信號(hào)通路[22]證實(shí)健脾消癌方通過(guò)多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)起到抗腫瘤的作用。

本實(shí)驗(yàn)在缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，同時(shí)用健脾消癌方含藥血清培養(yǎng)14 d后，采用定量Real-time PCR檢測(cè)SW620細(xì)胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果提示健脾消癌方能抑制缺氧誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞高表達(dá)HIF-1α;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIF-1α下游靶基因發(fā)生了相應(yīng)表達(dá)變化，其中VEGF、Bcl-2水平較對(duì)照組降低，Caspase-3較對(duì)照組升高;MMP-9、Survivin水平較對(duì)照組略有降低，但在本次實(shí)驗(yàn)中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于健脾消癌方引起的HIF-1α下調(diào)的程度不足以引起其下游靶基因MMP-9、Survivin表達(dá)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本次研究也證實(shí)健脾消癌方能抑制缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而引起下游一些促癌因子VEGF、Bcl-2表達(dá)降低，而抑癌因子Caspase-3表達(dá)升高，發(fā)揮抗癌效應(yīng)。

本研究觀察了健脾消癌方處理的結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為。健脾消癌方干預(yù)下，缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌SW620細(xì)胞在MTT實(shí)驗(yàn)的第0、24、48、72、96小時(shí)，細(xì)胞存活率分別為99%，107%，101%，89%和78%，整體生存曲線在對(duì)照組下方，其中在48、72和96 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，健脾消癌方干預(yù)的SW620細(xì)胞存活率較對(duì)照組降低。并且健脾消癌方干預(yù)的SW620細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，表明健脾消癌方能抑制缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)結(jié)腸癌的治療作用。Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)了健脾消癌方干預(yù)的缺氧結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的遷移和穿透小室的能力較對(duì)照組降低，說(shuō)明健脾消癌方能抑制缺氧環(huán)境中結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移。

綜上所述，健脾消癌方能抑制缺氧環(huán)境下結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減弱細(xì)胞遷移和侵襲能力，從而發(fā)揮抗癌作用。

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