壯骨止痛膠囊對(duì)去卵巢大鼠MAPK信號(hào)通路的影響

王桂云　吳結(jié)枝　雷曉明　李榮慧　曹寶丹　劉慧萍　張國(guó)民

〔摘要〕 目的 觀察壯骨止痛膠囊對(duì)去卵巢大鼠骨組織MAPK信號(hào)通路的影響，探討其治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的機(jī)制。方法 將36只SPF級(jí)SD雌性大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。隨機(jī)選定2組為空白組和假手術(shù)組，其余大鼠均進(jìn)行切除卵巢造模處理，即采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的去除雌性大鼠雙側(cè)卵巢方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病理模型，將造模成功的24只大鼠依次分為模型組、壯骨止痛膠囊組、雷帕酶素（rapamycin， RAPA）組和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine， 3-MA）組。術(shù)后第6天開始灌胃給藥，連續(xù)3個(gè)月。末次灌胃給藥后第2天開始取材。HE染色觀察骨組織病理形態(tài);ELISA檢測(cè)血清雌二醇（estradiol， E2）的含量;免疫組化法分析股骨ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表達(dá)。結(jié)果 （1）空白組和假手術(shù)組骨髓腔無(wú)明顯變化，模型組大鼠骨髓腔明顯擴(kuò)大，壯骨止痛膠囊組和RAPA組大鼠骨髓腔擴(kuò)大不明顯。（2）空白組和假手術(shù)組的血清E2含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與假手術(shù)組相比，模型組血清E2值降低，且有顯著性差異（P<0.01）;與模型組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組血清E2值升高、3-MA組血清E2值降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與3-MA組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組大鼠E2值升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。（3）空白組和假手術(shù)組骨組織ERK1/2、P38MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與假手術(shù)組相比，模型組骨組織的ERK1/2、P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組ERK1/2、P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)升高（P<0.01），3-MA組ERK1/2、P38 MAPK蛋白表達(dá)降低（P<0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與3-MA組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組的ERK1/2、P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且壯骨止痛膠囊組和RAPA組股骨組織ERK1/2、P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 壯骨止痛膠囊能升高血清中E2的表達(dá)，可能通過(guò)上調(diào)去勢(shì)大鼠骨組織中ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)控MAPK信號(hào)通路。

〔關(guān)鍵詞〕 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥;壯骨止痛膠囊;MAPK信號(hào)通路;雌二醇

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.02.009

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Zhuanggu Zhitong Capsule on MAPK signaling pathway in bone tissue of ovariectomized rats， and to explore the mechanism in treating postmenopausal osteoporosis. Methods 36 SPF female SD rats were randomly divided into 6 groups， with 6 rats in each group. Two groups were randomly selected as the blank group and the sham operation group， the other rats were ovariectomized to establish the pathological model of postmenopausal osteoporosis by removing bilateral ovaries of female rats， 24 rats with successful model were randomly divided into the model group， the Zhuanggu Zhitong Capsule group， the rapamycin （RAPA） group and the 3-methyladenine （3-MA） group. The drug was administered 6 days after operation for 3 months. The samples were taken from the second day after the last intragastric administration. The pathological morphology of bone tissue was observed by HE staining; the content of serum estradiol （E2） was detected by ELISA; the expressions of ERK1/2， p-ERK1/2， p38 MAPK and P-P38 MAPK were analyed by immunohistochemistry. Results （1） There was no significant change in the bone marrow cavity of the blank group and the sham operation group. The bone marrow cavity of the model group was significantly enlarged， while that of the Zhuanggu Zhitong Capsule group and the RAPA group was not. （2） Compared with the blank group， the level of serum E2 in the sham operation group was not statistically significant （P>0.05）. Compared with the sham operation group， the level of serum E2 in the model group was significantly lower， and there was a significant difference （P<0.01）. Compared with the model group， the serum E2 value of Zhuanggu Zhitong Capsule group and the RAPA group increased， and the serum E2 value of the 3-MA group decreased， with significant differences （P<0.01）. Compared with the 3-MA group， the E2 value in the Zhuanggu Zhitong Capsule group and the RAPA group increased， there were significant differences （P<0.01）. （3） There were no significant difference in the expressions of ERK1/2， p38 MAPK and phosphorylated protein of bone tissue between the sham operation group and the blank group （P>0.05）. Compared with the sham operation group， the expressions of ERK1/2， p38 MAPK and their phosphorylated protein of bone tissue in the model group were significantly lower， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with the model group， the expressions of ERK1/2， p38 MAPK and their phosphorylated proteins in the Zhuanggu Zhitong Capsule group and the RAPA group were significantly higher， and the difference were statistically significant （P<0.01）， and the expressions of ERK1/2， p38 MAPK and their phosphorylated proteins in 3-MA group were significantly lower， and the difference were statistically significant （P<0.01）. Compared with the 3-MA group， the expressions of ERK1/2， p38 MAPK and their phosphorylated proteins in the Zhuanggu Zhitong Capsule group and the RAPA group were significantly higher， and the difference were statistically significant （P<0.01）， there were no significant difference in the xpressions of ERK1/2， p38 MAPK and phosphorylated protein between the Zhuanggu Zhitong Capsule group and the RAPA group （P>0.05）. Conclusion Zhuanggu Zhitong Capsule can increase the expression of E2 in serum， and regulate MAPK signaling pathway by up regulating the protein expressions of ERK1/2， p-ERK1/2， p38 MAPK and P-P38 MAPK in bone tissue of ovariectomized rats.

〔Keywords〕 postmenopausal osteoporosis; Zhuanggu Zhitong Capsule; MAPK signaling pathway; estradiol

骨組織是一種更新的組織，由有機(jī)基質(zhì)的礦化持續(xù)形成。成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收有助于骨重塑平衡[1-2]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal

osteoporosis， PMOP）是由于雌激素缺乏引起的一種退行性疾病。根據(jù)2004年美國(guó)衛(wèi)生局報(bào)告，估計(jì)50歲以上的女性有50%的患脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)[3]。PMOP是一種常見(jiàn)的與年齡相關(guān)的退行性疾病，由于雌激素缺乏，從而影響絕經(jīng)后婦女。根據(jù)2004年美國(guó)衛(wèi)生局局長(zhǎng)的報(bào)告，估計(jì)50歲以上的女性有50%的患脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)[3]。PMOP引起的與骨折相關(guān)的發(fā)病率和死亡率，給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用證實(shí)壯骨止痛膠囊[4]可以維持骨代謝平衡，增加骨密度，減少骨折發(fā)生率和死亡率。近年研究[5-6]表明激活MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化來(lái)防治PMOP。有實(shí)驗(yàn)表明[7-8]，細(xì)胞自噬在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，但尚未有明確結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)采用的RAPA是一種與自噬相關(guān)且在進(jìn)化上相對(duì)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與壯骨止痛膠囊作為陽(yáng)性對(duì)照組。3-MA則是一種自噬抑制劑，與壯骨止痛膠囊作為陰性對(duì)照組。因此，該通路的激活可能是壯骨止痛膠囊通過(guò)細(xì)胞自噬治療PMOP的方式之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究壯骨止痛膠囊對(duì)去卵巢大鼠骨組織ERK1/2、p38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探索其基于MAPK信號(hào)通路治療PM0P的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠36只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量180～240 g，6～8周齡，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。造模前先適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)單位許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-005，動(dòng)物批號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)。環(huán)境溫度為（22±4） ℃，濕度為50%±10%，大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，飼料為標(biāo)準(zhǔn)普通飼料（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），保持環(huán)境安靜，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的要求。

1.2? 主要儀器

Ni-U研究型正置顯微鏡（尼康株式會(huì)社）;YJ-840型超凈工作臺(tái)（蘇州蘇信環(huán)境科技有限公司）;MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（中國(guó)北航公司）;DCW-3510恒溫水浴鍋（寧波新芝生物科技股份有限公司）;325型石蠟切片機(jī)（英國(guó)Shandon公司）。

1.3? 藥品與試劑

壯骨止痛膠囊（批號(hào)181006，四川美大康華康藥業(yè)有限公司）;雷帕霉素（批號(hào)38921， rapamycin，RAPA）、3-甲基腺嘌呤（批號(hào)402143， methyladenine， 3-MA）均購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express公司;PBS緩沖液（批號(hào)AD24464280，美國(guó)Hyclone公司）;注射用青霉素鈉（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）;DAB顯色試劑盒（批號(hào)K196721D，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;雌二醇試劑盒（批號(hào)bs-0925G），ERK1/2（批號(hào)bs-2637R）、p-ERK1/2（批號(hào)bs-3016R）、p38 MAPK（批號(hào)bs-0637R）及p-p38 MAPK（批號(hào)bs-5477R）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1? 分組造模

按照數(shù)字表法將36只大鼠分為6組，每組6只。隨機(jī)選定2組為空白組和假手術(shù)組，其余大鼠均采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的去除雌性大鼠雙側(cè)卵巢方法建立PMOP病理模型，將造模成功的24只大鼠依次分為模型組、壯骨止痛膠囊組、RAPA組和3-MA組?，F(xiàn)配10%的水合氯醛溶液，假手術(shù)組和造模組的大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉（每100 g體質(zhì)量注射1 mL）;將麻醉大鼠俯臥位固定于鼠板上，沿下腹部正中線切口打開腹腔，撥開脂肪層找到卵巢;造模組大鼠完整摘除雙側(cè)卵巢并結(jié)扎;假手術(shù)組僅打開腹腔，不切除雙側(cè)卵巢;止血完全后分兩層縫合腹腔，切口碘伏消毒，為防止術(shù)后感染，術(shù)后連續(xù)3天在假手術(shù)組和造模組大鼠后腿肌肉內(nèi)側(cè)注射青霉素，每只4×104 U/d，500 μL/只，6天后拆線，空白組不做任何處理。

2.2? 給藥方法

將RAPA、3-MA溶解在提前配置的油相溶劑中。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RAPA、3-MA的適宜濃度分別為6 mg/kg、8 mg/kg，術(shù)后第6天開始給藥。各藥物劑量按人-大鼠體表面積折算來(lái)確定。壯骨止痛膠囊為0.45 g/粒，成人劑量為12粒/d，換算成大鼠壯骨止痛膠囊高濃度為1.944 g/（kg·d），具體給藥方式為：空白組、假手術(shù)組、模型組和壯骨止痛膠囊組每天腹腔注射油相溶劑1 mL，其中前三組灌胃2 mL水，最后一組灌胃2 mL壯骨止痛膠囊溶液;RAPA組和3-MA組每天分別腹腔注射RAPA溶液1 mL、3-MA溶劑1 mL，兩組均灌胃2 mL水;各組大鼠連續(xù)灌喂13周后取材。

2.3? 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1? 骨組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)? 取左側(cè)股骨，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)脫水、透明、切片、烤片、紅染后，最后封片，待玻片干燥后送至湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理檢驗(yàn)中心檢測(cè)骨組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.3.2? ELISA檢測(cè)血清雌二醇（estradiol， E2）的含量? 取出保存在冰箱里的各組腹主動(dòng)脈血清，待血清融化以后進(jìn)行E2的檢測(cè)。按照雙抗體夾心技術(shù)對(duì)該指標(biāo)進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3.3? 免疫組化測(cè)定骨組織ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)? 取右側(cè)股骨，4%多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)脫水、透明、切片、冷修復(fù)后，在每塊載玻片上滴加配制的一抗進(jìn)行孵育，置于室溫37 ℃ 2 h或置于4 ℃過(guò)夜。用PBS洗3次，每次3 min，再加入二抗，置于室溫37 ℃ 1 h。用PBS清洗干凈，每塊載玻片滴加200 μL DAB顯色液，置于室溫37 ℃下5～10 min后加水終止反應(yīng)。加水沖洗一遍后加入適量蘇木素染液復(fù)染，置于室溫2 min后加水洗3次，每次3 min。最后中性樹膠封片。干燥后在顯微鏡下進(jìn)行切片的視野觀察，對(duì)ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白的平均灰密度值進(jìn)行比較分析。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，用正態(tài)性檢驗(yàn)和方差分析，方差齊則組間多重比較采用LSD法，若方差不齊則采用Games-Howell法比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用“x±s”表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? HE染色觀察各組去卵巢大鼠骨組織病理形態(tài)學(xué)變化

空白組和假手術(shù)組骨髓腔無(wú)明顯變化，模型組大鼠骨髓腔明顯擴(kuò)大，骨小梁稀疏，說(shuō)明模型組大鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥的病理形態(tài)學(xué)改變;與模型組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組大鼠骨髓腔擴(kuò)大不明顯，骨小梁密度較均勻，說(shuō)明壯骨止痛膠囊能有效改善PMOP模型大鼠的骨微量結(jié)構(gòu)，防治PMOP。見(jiàn)如圖1。

3.2? ELISA檢測(cè)各組血清中E2含量

與空白組相比，假手術(shù)組大鼠血清E2含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與假手術(shù)組相比，模型組血清E2值降低，且有顯著性差異（P<0.01）。與模型組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組血清E2值升高、3-MA組血清E2值降低，且有顯著性差異（P<0.01）。與3-MA組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組大鼠E2值升高，具有顯著性降低（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3? 免疫組化測(cè)定骨組織ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平

與空白組比較，假手術(shù)組骨組織ERK1/2、P38

MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組骨組織的ERK1/2、P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組ERK1/2、P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），3-MA組ERK1/2、P38 MAPK蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與3-MA組相比，壯骨止痛膠囊組和RAPA組的ERK1/2、P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且壯骨止痛膠囊組和RAPA組股骨組織ERK1/2、P38 MAPK及其磷酸化蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3及表1、表2。

4 討論

PMOP是存在于中老年婦女中的一種高發(fā)性疾病。從中醫(yī)角度來(lái)說(shuō)，老年人腎氣不足，筋骨失去了腎的濡養(yǎng);陰精不足，血阻骨絡(luò)，使得筋骨堅(jiān)韌不足，故而易受外傷而骨折。骨質(zhì)疏松癥是老年患者骨折的主要衰弱原因，降低了患者的生活質(zhì)量。骨穩(wěn)態(tài)是通過(guò)骨形成成骨細(xì)胞和骨吸收破骨細(xì)胞來(lái)維持的。壯骨止痛膠囊以補(bǔ)骨脂、淫羊藿、牛膝、枸杞子等藥物為主要成分。多項(xiàng)體外研究[9-10]表明，淫羊藿能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的礦化能力，并且具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的功能;同時(shí)，補(bǔ)骨脂、牛膝等藥材也具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的功效[11-12]。在淫羊藿等藥物的作用下，破骨細(xì)胞的形成和增殖受到了抑制，保持了骨小梁結(jié)構(gòu)的完整，阻止了PMOP的發(fā)生。

研究[13]表明，MAPK信號(hào)通路在PMOP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。ERK是MAPK家族的成員，ERK1和ERK2是其最主要的兩種形式，其參與了許多不同的細(xì)胞事件，包括增殖、生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞存活、代謝和轉(zhuǎn)錄，在維持骨結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)平衡中起到至關(guān)重要的作用[14-15]。Prasadam I等[16]研究表明，當(dāng)骨細(xì)胞在骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，軟骨下骨成骨細(xì)胞成骨基因的表達(dá)隨著ERK1/2磷酸化的作用而增加;Yang Y等[17]研究表明，趨化因子配體2（CXCL2）在骨髓中富集，并在骨質(zhì)疏松小鼠的成骨細(xì)胞中顯示出豐富的表達(dá)。CXCL2的過(guò)度表達(dá)抑制了成骨細(xì)胞的增殖和分化，相反，CXCL2的下調(diào)促進(jìn)了成骨細(xì)胞的擴(kuò)張和分化。在機(jī)制上，CXCL2抑制成骨細(xì)胞中的ERK1/2信號(hào)通路，ERK1/2的激活消除了CXCL2對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用，而ERK1/2失活逆轉(zhuǎn)了CXCL2抑制的成骨作用，皆表明ERK1/2可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

MAPK蛋白通路還包括p38 MAPK這一重要通路，MAPK級(jí)聯(lián)是一種廣泛研究的信號(hào)通路，在骨骼發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化[18-19]。p38 MAPK信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及凋亡中起著至關(guān)重要的作用[20]。已證實(shí)p38 MAPK通路在細(xì)胞增殖和成骨分化[21-22]中起著關(guān)鍵作用。Shang Q等[23]研究發(fā)現(xiàn)龍蛇蘭提取物可以促進(jìn)p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK蛋白的表達(dá)，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化，表明通過(guò)p38 MAPK通路治療骨質(zhì)疏松癥具有潛在依據(jù)。Cong Q等[24]研究表明p38 MAPK在充質(zhì)干細(xì)胞中可被雌激素激活，從而控制骨保護(hù)素的表達(dá)。調(diào)節(jié)破骨發(fā)生和骨吸收，從而防治骨質(zhì)疏松癥。Thouverey C等[25]發(fā)現(xiàn)，消融成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞中的p38 MAPK信號(hào)路可以保護(hù)小鼠免受雌激素缺乏引起的骨丟失，其中P38 MAPK蛋白在骨髓中最豐富，表明p38 MAPK通路在維持生理性骨穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠股骨組織進(jìn)行了ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白的免疫組化染色，研究結(jié)果顯示，壯骨止痛膠囊組和RAPA組ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK表達(dá)均高于模型組及3-MA組，表明壯骨止痛膠囊和RAPA能正向調(diào)節(jié)ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK的蛋白表達(dá)。E2是女性最主要的“骨激素”，E2水平的降低會(huì)引發(fā)骨量流失[26]。絕經(jīng)期婦女卵巢功能減退，E2分泌減少，骨形成與骨吸收偶聯(lián)失衡，骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致骨密度減少、骨結(jié)構(gòu)破壞、增加骨折風(fēng)險(xiǎn)[27]。本研究同時(shí)檢測(cè)了各組大鼠血清雌激素的含量，壯骨止痛膠囊組大鼠和RAPA組大鼠的雌激素水平較模型組及3-MA組明顯升高，表明壯骨止痛膠囊和RAPA同雌激素功用相似，通過(guò)正向調(diào)控MAPK通路中ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)骨形成。本實(shí)驗(yàn)對(duì)ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白的研究，僅從免疫組化染色這一個(gè)方面來(lái)探討，有一定的局限性，MAPK信號(hào)通路尚有諸多分子，且壯骨止痛膠囊和細(xì)胞自噬對(duì)其作用機(jī)制尚不明確，有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

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