浙江天目山蟬花蟲草的分離及基質(zhì)栽培

饒雨欣，郎茂榮，江宏，童小青，王勇軍*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.杭州臨安華茵生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311300)

蟬花蟲草(Cordycepscicadae)又名蟬茸、蟲花、蟬蟲草、蟬茸菌，為蟬棒束孢菌真菌寄生于蟬若蟲后形成的菌蟲復(fù)合體，是我國一種傳統(tǒng)的藥食兩用真菌。宋代唐慎微《經(jīng)史證類備急本草》記載“味甘，寒，無毒；主小兒天吊，驚癇螈，夜啼心悸；所在皆有，七月采；生苦竹林者良，花出土上”。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，蟬花含有糖原、甘露醇、多種生物堿、蛋白質(zhì)、多種氨基酸及多種微量元素等化學(xué)成分，具有免疫調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、改善腎功能、降血糖、抗腫瘤等藥理作用[1-2]。蟬花蟲草為世界性廣布種，在我國分布于秦嶺淮河以南，主要生長于熱帶和亞熱帶的闊葉林、針闊葉混交林及竹林等生境中[3]。蟬花蟲草的寄主主要包括山蟬Cicadaeflammata、蟪姑Platypleurakaempferi、黑蚱Crytotympanapustulata、竹蟬Platylomiapieli等蟬科昆蟲[4]。筆者在浙江省杭州市天目山區(qū)進(jìn)行資源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟬花蟲草廣泛分布于竹林中，長期被當(dāng)?shù)刂褶r(nóng)采收并作為藥用真菌。本研究從天目山竹林土壤感染竹蟬中分離獲得1株蟬花蟲草菌株TM06，并進(jìn)行了人工栽培探索，為蟬花蟲草資源開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟬花蟲草菌株

蟬花蟲草分離物TM06采集于浙江省杭州市臨安區(qū)天目山竹林(119°31′1″E 30°20′7″N)土壤感染的竹蟬。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

M1液體培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖30 g，K2HPO40.5 g，MgSO41 g，檸檬酸銨1 g，蛋白胨3 g，復(fù)合維生素B 150 mg，水1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

小麥基質(zhì)培養(yǎng)基。每個(gè)玻璃培養(yǎng)瓶(5 cm×5 cm×10 cm)分別裝入約25 g小麥和20 mL的M1液體培養(yǎng)基，添加不同量的蟬蛹粉，混勻后121 ℃滅菌30 min。

市售蟬蛹粉，過0.15 mm篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分離

用小鏟子取露出蟬花的蟲體，拭去黏附土壤，置于取樣袋中，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離純化。用剪刀剪取蟬花組織，表面用75%酒精消毒10 s后，用無菌水進(jìn)行沖洗2遍后，用鑷子撕開表皮，取長、寬為1 mm大小的組織塊，接種于PDA培養(yǎng)皿中，避光條件下24 ℃培養(yǎng)。待菌絲長出，用挑針挑取少量菌絲置于新鮮PDA培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌絲形態(tài)，獲得純培養(yǎng)物。

1.2.2 ITS-PCR及序列測定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工?，上海)進(jìn)行真菌菌絲總DNA的提取，采用真菌核糖體基因間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4(5′TCC TCCGCTTATTGATATGC3′)對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為94 ℃，5 min；94 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，8 min。將擴(kuò)增得到的DNA片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測序，采用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接。序列采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，采用Maximum Likelihood analysis進(jìn)行分析，自展數(shù)據(jù)(bootstrap)為1 000次[5]。

1.2.3 蟬花蟲草的人工栽培

取在PDA培養(yǎng)基生長的蟬花蟲草菌絲塊，置于M1液體培養(yǎng)基中，160 r·min-1，22 ℃黑暗條件進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d，至菌絲小球長出，用小型攪拌器混勻后，吸取1 mL菌液添加至含有不同濃度蟬蛹粉的小麥基質(zhì)培養(yǎng)基，黑暗條件22 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)瓶，進(jìn)行光照誘導(dǎo)(黑暗12 h/光照12 h)，待生長成熟后，取子座組織進(jìn)行稱重。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS v.19數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花蟲草TM06的分離培養(yǎng)及人工基質(zhì)栽培

采集的蟬花是由蟲體和孢梗束兩部分組成的生物體，寄生的蟬若蟲較大，表面披覆著灰白或灰黃色的茸毛狀菌被。蟬花子座一般單生、2個(gè)或多個(gè)，不分支，呈棒狀、褐色；蟬花的孢梗束由蟬的前端長出，單生或叢生，上部反復(fù)分枝，分枝頂端膨大(圖1中A)。蟬花菌絲在PDA培養(yǎng)基上菌絲白色，稀松，底部產(chǎn)紅色色素，易形成孢子(圖1中B)。

蟬花蟲草TM06菌株在小麥基質(zhì)培養(yǎng)基上培養(yǎng)將近10 d后，白色菌絲布滿整個(gè)基質(zhì)；15 d后，子座形成，有子實(shí)體長出，菌體顏色加深，呈淡黃色；40 d后，子實(shí)體生長茂密，高5～7 cm，直徑1～3 mm，頂部有大量珊瑚狀分支，子實(shí)體成熟(圖1中C)。

圖1 蟬花蟲草TM06的分離(A和B)及基質(zhì)栽培(C)

2.2 蟬花蟲草TM06的ITS遺傳系統(tǒng)分析

利用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得蟬花蟲草TM06的ITS部分序列，NCBI登錄號為MW040504。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析結(jié)果顯示，TM06與蟬花蟲草QCS2007071701菌株和JGS2014061604菌株親緣關(guān)系最近，構(gòu)成1個(gè)分支(圖2)。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 添加不同濃度的蟬蛹粉對TM06子實(shí)體產(chǎn)量的影響

在小麥基質(zhì)培養(yǎng)基中分別添加2%、5%、10%和15%(重量百分比)的蟬蛹粉，測定蟬蛹粉對蟬花蟲草TM06子實(shí)體生長的影響。由表1可知，小麥基質(zhì)培養(yǎng)基中添加蟬蛹粉后，子實(shí)體干重明顯提高。其中，添加5%的蟬蛹粉效果最佳，子實(shí)體每瓶平均干重達(dá)到11.61 g。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟬蛹粉添加超過10%時(shí)，反而降低了子實(shí)體的產(chǎn)量。

表1 不同濃度蟬蛹粉對蟬花蟲草TM06子實(shí)體產(chǎn)量的影響

3 小結(jié)與討論

蟲草屬真菌的資源挖掘和人工栽培，是當(dāng)前研究和開發(fā)的熱點(diǎn)，對功能食品開發(fā)和野生資源保護(hù)均具有重要意義[6]。本研究從浙江天目山竹林感染的蟬若蟲上分離獲得1株蟬花蟲草TM06，采用小麥基質(zhì)培養(yǎng)基完成了該菌株的人工栽培，并測定了蟬蛹粉對TM06菌株人工栽培下的增效作用。研究結(jié)果明確了浙江天目山竹林蟬花的菌種特性，并建立了人工栽培技術(shù)。蟬花蟲草的藥理成分及藥效功能已取得重要進(jìn)展[1,7-8]，但不同來源、不同栽培方式的蟲草，在藥理成分及功效上可能存在差異[9]。下一步將圍繞人工栽培的蟬花蟲草的藥理學(xué)成分及功效開展研究。