不同刮痧力度對(duì)大鼠皮膚形態(tài)及5-羥色胺、肥大細(xì)胞表達(dá)變化的比較研究?

楊昆吾，楊金生，徐東升，王瑩瑩△，劉 惠，陳淑敏，吉 佳

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700)

刮痧是指在中醫(yī)經(jīng)絡(luò)腧穴理論指導(dǎo)下，使用不同材質(zhì)與形狀的刮痧器具，在體表進(jìn)行相應(yīng)的手法刮拭，以防治疾病的中醫(yī)外治法[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，刮痧是通過(guò)刺激穴位、皮膚經(jīng)絡(luò)，將體內(nèi)邪氣驅(qū)逐出體表，從而達(dá)到活血通絡(luò)、增強(qiáng)臟腑功能的作用[2]，不僅在臨床上應(yīng)用廣泛，而且在養(yǎng)生保健方面也發(fā)揮著重要作用[3-5]。通過(guò)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用刮痧板刺激穴區(qū)可使其刺激部位的微細(xì)血管擴(kuò)大或破裂， 從而使皮膚產(chǎn)生形態(tài)變化形成“痧象”，作為一種刺激源激活并持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6]。有學(xué)者[7]觀察到，刮痧可以增加人體刮拭區(qū)域局部皮膚微循環(huán)，以達(dá)到緩解疼痛的作用。Spohn D等[8]認(rèn)為，刮痧作用的產(chǎn)生是通過(guò)對(duì)局部皮膚的刺激，使皮膚和血管感受器產(chǎn)生反射，隨后傳導(dǎo)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)其興奮和抑制過(guò)程起到平衡作用，強(qiáng)化對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)和控制。我們前期的臨床研究表明，循經(jīng)和“出痧”是影響臨床療效的重要因素[9]。然而目前對(duì)于刮痧機(jī)制的研究、對(duì)于刮痧力度都沒(méi)有一個(gè)準(zhǔn)確的說(shuō)明?，F(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)在刮痧力度方面，也缺少明確的量化標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致臨床只能根據(jù)醫(yī)生自己的經(jīng)驗(yàn)和習(xí)慣對(duì)患者進(jìn)行刮痧，這使得刮痧在臨床規(guī)范應(yīng)用與理論研究方面的發(fā)展受到制約，也影響了國(guó)際上對(duì)于刮痧的認(rèn)可程度和傳播[10]。

本研究認(rèn)為刮痧力度的大小，是決定刮痧治療效果的主要因素之一，在確保刮痧的次數(shù)、時(shí)間、頻率等相對(duì)一致的情況下，運(yùn)用自行研制的刮痧力度檢測(cè)儀，探索不同力度(強(qiáng)度)對(duì)刮痧效果的影響具有實(shí)際意義。本研究的實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)審查批準(zhǔn)號(hào)中科針倫D2019-12-25-1。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(220±10)g，隨機(jī)分為正常組、輕刮痧組、中刮痧組和重刮痧組每組各6只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCKX(京)2016-0001。在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所動(dòng)物房(清潔級(jí))喂養(yǎng)，自然照明，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照并嚴(yán)格遵循2006年國(guó)家發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[11]進(jìn)行開(kāi)展。

1.2 試劑與儀器

異氟烷(中國(guó)九派制藥有限公司);羊抗5-HT抗體(批號(hào)ab66047)，美國(guó)Abcam公司；小鼠抗Mast cell抗體(批號(hào)ab2378)，美國(guó)Abcam公司；Alexa 594熒光素化的驢抗小鼠抗體，美國(guó)Molecular Probes公司；Alexa 594熒光素化的驢抗羊抗體，美國(guó)Molecular Probes公司；核酸特異性熒光染料 DAPI，美國(guó)Mo-lecular Probes公司；Alexa 488 熒光素化的鬼筆環(huán)肽，美國(guó)MolecularProbes公司。

Matrx VMR小動(dòng)物麻醉機(jī)(美國(guó)Midmark公司)；Thermo FSE恒冷箱切片機(jī)(德國(guó)MicromInternational公司)；BX53研究級(jí)正置顯微鏡(日本Olympus公司)；FV 1200全光譜掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)；刮痧力度測(cè)量?jī)x(天津明通世紀(jì)科技有限責(zé)任公司)。

1.3 刮痧干預(yù)

采用自行研制的刮痧力度測(cè)量?jī)x。圖1示，穴位選取大鼠右后肢“陽(yáng)陵泉”穴(距后三里上外側(cè)5 mm，腓骨小頭前下方凹陷處)穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》“常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位”[12]。剃除雙后肢及下背部毛發(fā)，充分暴露“陽(yáng)陵泉”穴區(qū)皮膚組織，用特制的刮痧力度測(cè)量?jī)x對(duì)其進(jìn)行干預(yù)。穴區(qū)刮拭范圍控制在15 mm×10 mm，輕刮痧組使用0.4 kgf力，中刮痧組使用0.8 kgf力，重刮痧組使用1.2 kgf力，每組均刮拭20次，干預(yù)1次，完成后即刻取材。

圖1 大鼠“陽(yáng)陵泉”穴定位及操作

1.4 灌流取材

不同程度刮痧刺激后即刻對(duì)仍處于深度麻醉狀態(tài)下的大鼠進(jìn)行心臟灌流，先用0.9%氯化鈉溶液沖凈血液，隨后灌入(320±10)mL含4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值為7.4)的固定液，約15 min灌流完畢。在灌流后大鼠右側(cè)陽(yáng)陵泉穴區(qū)分別縱向切取長(zhǎng)約15 mm、寬約10 mm的皮膚組織，將其放置于上述同樣固定液中固定2 h，再換到含25%蔗糖的0.1 mol/L PB液(pH 值為7.4)中，放置于4 ℃冰箱中約2 d，直至組織完全下沉。

1.5 熒光免疫組織化學(xué)染色

采用恒冷箱切片機(jī)進(jìn)行組織切片。先用組織包埋劑將皮膚組織黏貼在支架上，待組織凍結(jié)后沿縱向制成矢狀切片，厚度為20 μm，直接貼在陽(yáng)離子載玻片上，然后放于室內(nèi)陰干。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

組織切片用0.1 mol/L PB液清洗3次，待組織膠清洗干凈后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈，將封閉液[3%驢血清，0.5% Triton X-100和0.1 mol/L PB(pH值為7.4)]用移液器滴加到組織切片上孵育，期間配置稀釋液[1%驢血清、0.5% TritonX-100和0.1 mol/L PB(pH值為7.4)],1 h后移去封閉液，分別滴加羊抗5-HT抗體(1∶500)、小鼠抗MC抗體(1∶1000)的稀釋液，并將裝有組織切片的濕盒置于4 ℃冰箱中過(guò)夜。次日經(jīng)0.1 mol/L PB液清洗3次后，加入含Alexa 594熒光素化的驢抗小鼠抗體(1∶500)、驢抗羊抗體(1∶500)、Alexa 488熒光素化的鬼筆環(huán)肽(1∶500)、核酸特異性熒光染料DAPI(1∶50000)的上述稀釋液，于室溫內(nèi)靜置2 h后，用0.1 mol/L PB液清洗3次。待組織切片風(fēng)干后，滴加50%甘油，加蓋玻片完成標(biāo)本制作。整個(gè)操作過(guò)程中注意避光。

組織標(biāo)本用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察及拍照。圖片進(jìn)行標(biāo)注和編輯,之后先進(jìn)行局部組織皮膚形態(tài)觀察，再對(duì)每組組織切片在熒光顯微鏡10倍視野下分別選取12個(gè)面積相同的區(qū)域進(jìn)行肥大細(xì)胞(mast cell，MC)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同程度刮痧對(duì)大鼠“陽(yáng)陵泉”穴區(qū)局部組織皮膚的影響

圖2示，輕刮痧組大鼠皮膚變化不明顯，輕微發(fā)紅，有少量痧點(diǎn)；中刮痧組出痧較多，皮膚普遍發(fā)紅，皮下充血明顯；重刮痧組出現(xiàn)一定皮膚受損并伴有皮下出血，說(shuō)明重刮痧會(huì)引起皮膚組織損傷。

圖2 不同力度刮痧后大鼠情況(從右至左依次為正常組、輕刮痧組、中刮痧組、重刮痧組)

2.2 不同程度刮痧對(duì)大鼠“陽(yáng)陵泉”穴區(qū)局部組織免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)免疫熒光結(jié)果觀察到，輕刮痧組皮膚組織形態(tài)無(wú)明顯變化，中刮痧組表皮層結(jié)構(gòu)排列紊亂，少數(shù)毛囊發(fā)生破裂，重刮痧組皮膚組織形態(tài)明顯紊亂，毛細(xì)血管破裂，真皮下層及皮下組織未見(jiàn)完整血管結(jié)構(gòu)?！瓣?yáng)陵泉”穴區(qū)局部組織的表皮層、真皮層和皮下組織均有5-HT和MC的陽(yáng)性標(biāo)記，與空白組比較(圖3 A、5A)，輕刮痧組(圖3B、5B)在真皮層和皮下組織中沿毛囊與血管形成連續(xù)的增強(qiáng)帶；中刮痧組(圖3C、5C)陽(yáng)性標(biāo)記呈下降趨勢(shì)；重刮痧組(圖3D、5D)陽(yáng)性標(biāo)記明顯減少。

圖4示，通過(guò)對(duì)5-HT和MC的陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)觀察到，與空白組比較輕刮痧組5-HT陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)明顯升高(P<0.01)，中刮痧組5-HT陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，重刮痧組5-HT陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)降低(P<0.05)。圖6示，與空白組比較，輕刮痧組MC陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)明顯升高(P<0.01)，中刮痧組MC陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，重刮痧組MC陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)顯著降低(P<0.01)。

注：空白組(A,A1)；輕刮痧組(B,B1)；中刮痧組(C,C1)；重刮痧組(D,D1)；5-HT(紅)；PHA(綠)；DAPI(藍(lán))染色對(duì)比圖片；Epi代表表皮層，Der代表真皮層，A1、B1、C1、D1分別為圖A、B、C、D中白色方框標(biāo)記處的放大圖片

注：與空白組比較：輕刮痧組P<0.01,重刮痧組P<0.05

注：空白組(A,A1)；輕刮痧組(B,B1)；中刮痧組(C,C1)；重刮痧組(D,D1)；Mast cell(紅)，PHA(綠)、DAPI(藍(lán))染色對(duì)比圖片；Epi代表表皮層，Der代表真皮層，A1、B1、C1、D1分別為圖A、B、C、D中白色箭頭標(biāo)記處的放大圖片

注：與空白組比較：輕刮痧組P<0.01,重刮痧組P<0.01

3 討論

本研究對(duì)于刮痧力度測(cè)量?jī)x的創(chuàng)新應(yīng)用，使得刮痧操作過(guò)程中力度這一指標(biāo)得以量化控制，結(jié)合熒光免疫組織化學(xué)染色，從皮膚組織形態(tài)與局部化學(xué)物質(zhì)活性的變化，探究刮痧力度對(duì)于穴區(qū)局部的效應(yīng)特點(diǎn)。通過(guò)研究結(jié)果觀察到，輕刮痧(0.4 kgf)對(duì)大鼠局部皮膚表明影響不明顯，僅有少量痧點(diǎn)，真皮層與皮下組織中5-HT和MC表達(dá)升高；中刮痧(0.8 kgf)使大鼠皮膚表面發(fā)紅加重，皮下充血加重明顯，5-HT和MC表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢(shì)；重刮痧(1.2 kgf)使得皮膚受損，并伴有皮下出血5-HT和MC表達(dá)降低。

“陽(yáng)陵泉”穴為八會(huì)穴之“筋會(huì)”，屬于人體筋骨疼痛與膽腑病癥常用穴位，位于腓總神經(jīng)分為腓淺及腓深神經(jīng)處。在課題組前期研究中[13]，發(fā)現(xiàn)該穴位皮膚較為淺薄、出痧明顯、操作方便、易于觀察，所以選擇該穴位；同時(shí)通過(guò)研究觀察到，刮痧可以使穴區(qū)局部皮膚表皮層組織增厚，毛細(xì)血管擴(kuò)張。選擇不同力度是基于臨床應(yīng)用過(guò)程中的輕刮法(補(bǔ)法)、中刮法(平補(bǔ)平瀉)和重刮法(瀉法)[14]。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，輕刮痧(0.4 kgf)和中刮痧(0.8 kgf)不會(huì)造成局部皮膚組織形態(tài)受損，重刮痧(1.2 kgf)會(huì)引起局部皮膚組織形態(tài)受損，毛細(xì)血管破裂，造成刺激嚴(yán)重，說(shuō)明適度的刮痧不會(huì)引起皮膚形態(tài)損傷，刮痧過(guò)力度過(guò)大可能會(huì)使皮膚受損嚴(yán)重。本研究從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物角度證明，臨床上輕(補(bǔ)法)和中(平補(bǔ)平瀉)手法是安全的，但是在應(yīng)用重(瀉法)手法時(shí)需謹(jǐn)慎。

現(xiàn)代研究表明，皮膚及其與人體所連接部分能夠分泌多種激素，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，并通過(guò)多種分泌機(jī)制發(fā)揮作用。該過(guò)程中刮痧可能起到推動(dòng)作用[15-18]。有研究[19-20]采用刮痧法治療坐骨神經(jīng)痛患者，臨床效果顯著，說(shuō)明刮痧緩解疼痛方面有很好的治療作用，因此本研究選擇對(duì)5-HT進(jìn)行測(cè)定。5-HT作為一種外周致痛遞質(zhì)，參與機(jī)體痛覺(jué)、情緒、體溫等多種生理功能的調(diào)節(jié)，同時(shí)分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，參與鎮(zhèn)痛作用的信息傳導(dǎo)，對(duì)相關(guān)疾病的機(jī)制具有重要意義[21-22]。課題組前期研究表明，刮痧刺激可引起人體局部皮膚組織中肥大細(xì)胞(MC)發(fā)生脫顆?，F(xiàn)象[23]。MC作為機(jī)體的初級(jí)免疫細(xì)胞，是人體的防御系統(tǒng)，主要分布在皮膚真皮層及皮下組織，尤其在經(jīng)穴區(qū)域數(shù)目較多，是人體免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)等系統(tǒng)信號(hào)的放大和調(diào)節(jié)細(xì)胞，對(duì)于維持人體系統(tǒng)平衡有重要作用[24]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到，輕刮痧對(duì)穴區(qū)組織中5-HT和MC的表達(dá)起到顯著上調(diào)作用，中刮痧開(kāi)始出現(xiàn)下降，重刮痧明顯減少，提示刮痧的作用機(jī)制可能與其所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。結(jié)合前期研究[25]更加肯定認(rèn)為，刮痧調(diào)節(jié)穴區(qū)局部皮膚組織中化學(xué)物質(zhì)的變化，可能是刮痧產(chǎn)生效應(yīng)的重要環(huán)節(jié)之一。輕刮痧能更有效地激活穴區(qū)局部皮膚中的各類(lèi)細(xì)胞，促使相關(guān)激素和活性物質(zhì)的釋放，有助于刮痧對(duì)人體產(chǎn)生良好的調(diào)節(jié)作用，但是更大力度的刮痧效果不佳，又或?qū)τ诓煌臋C(jī)體狀態(tài)能產(chǎn)生一定的作用，有待進(jìn)一步研究。通過(guò)本研究對(duì)這2種化學(xué)物質(zhì)的變化趨勢(shì)說(shuō)明，適度刮痧會(huì)引起局部皮膚化學(xué)物質(zhì)的表達(dá)響應(yīng)變化，刮痧后穴區(qū)局部組織響應(yīng)不會(huì)隨著刮痧力度的增加而增加，甚至出現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。

綜上所述，刮痧的作用與刮痧力度有著一定的聯(lián)系，且輕刮痧(0.4 kgf)更適用于大鼠實(shí)驗(yàn)研究，有助于提升穴區(qū)局部化學(xué)物質(zhì)的表達(dá)，并非力度越大越有效;重刮痧手法會(huì)對(duì)皮膚造成損傷，使局部皮膚嚴(yán)重受損且形態(tài)紊亂，毛細(xì)血管破裂，這可能是導(dǎo)致活性物質(zhì)表達(dá)降低的重要原因，在臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)慎重考慮。輕刮痧對(duì)于皮膚組織中5-HT的提升，推測(cè)該手法在臨床應(yīng)用過(guò)程中起到一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用，而對(duì)于MC的提升，說(shuō)明該手法有助于MC在穴區(qū)聚集，推動(dòng)免疫、神經(jīng)、生長(zhǎng)等因子的釋放，推測(cè)有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)的作用；同時(shí)在課題組前期研究工作中觀察到，重刮痧可增加動(dòng)物與人體穴區(qū)局部血流灌注量，提高局部溫度，起到促進(jìn)代謝、活血通絡(luò)的作用[26-28]，說(shuō)明該手法可能對(duì)于寒性疾病和慢性疾病恢復(fù)有一定的效果。推測(cè)穴區(qū)局部血流灌注量、溫度和皮膚形態(tài)產(chǎn)生的變化，可能是影響穴區(qū)局部活性物質(zhì)表達(dá)變化的主要因素,而力度是對(duì)于這些因素造成影響的直接原因。最后需要說(shuō)明的是，本研究只局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并且采用健康的動(dòng)物模型，對(duì)于應(yīng)用于人體以及不同疾病的最佳刮痧力度還需進(jìn)一步考究；同時(shí)在研究過(guò)程中作為固定變量的刮痧次數(shù)也是影響刮痧程度的關(guān)鍵因素。在今后研究中有待進(jìn)一步拓展刮痧力度、次數(shù)與出痧程度間的相互關(guān)系，為今后實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和科學(xué)規(guī)范刮痧的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，促進(jìn)刮痧的發(fā)展與傳承。