分子對(duì)接法和光譜法研究BRCA1846-871及其 五突變肽與RAD51181-200相互作用

符林娜, 曹孟杰, 趙東欣,盧 奎,*

(1. 河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450001; 2. 鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044)

乳腺癌易感基因1(BRCA1)的突變與遺傳性乳腺癌有關(guān)[1]。藥物治療能有效殺死腫瘤細(xì)胞，從而治療癌癥。同時(shí)，也會(huì)損壞正常細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，從而降低療效[2]。RAD51蛋白作為同源重組修復(fù)雙鏈DNA斷裂的重要蛋白，與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)[3]。研究表明，RAD51在許多腫瘤患者的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[4]。隨著體內(nèi)DNA修復(fù)能力的增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的耐受性增加。因此，探索BRCA1突變體和RAD51之間是否有強(qiáng)相互作用具有重要意義。

BRCA1是針對(duì)乳腺癌的“抑癌基因”，參與細(xì)胞正常生長(zhǎng)、DNA損傷修復(fù)等過(guò)程[5]。從BRCA1的結(jié)構(gòu)特征來(lái)看，BRCA1可以與RAD51、p53、BRAD1等多種蛋白結(jié)合[6]。BRCA1基因測(cè)序結(jié)果顯示，其與RAD51相互作用的保守序列有2段，氨基酸編碼分別為782-786和846-871[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的保守序列BRCA1846-871的五個(gè)特殊結(jié)合位點(diǎn)易發(fā)生突變，分別是Y856、K862、R866、Q867和P871[8]。在本研究中，選擇五個(gè)活性位點(diǎn)進(jìn)行全突變研究。

同源重組修復(fù)在維持細(xì)胞遺傳穩(wěn)定和正常生命功能中發(fā)揮作用，RAD51的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)DNA同源重組修復(fù)能力的增強(qiáng)和腫瘤細(xì)胞的耐受性[9]。因此，影響RAD51的修復(fù)功能，可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)化療和放療的耐藥性。實(shí)驗(yàn)表明，BRCA1與RAD51相互作用增強(qiáng)RAD51重組酶活性[10]。目前，主要集中于BRCA1與RAD51完整蛋白的相互作用研究，對(duì)RAD51關(guān)鍵肽段的研究較少。與天然的蛋白質(zhì)相比，多肽可通過(guò)化學(xué)方法合成、分離和純化。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，RAD51181-200(SGSDVLD NVAYARAFNT DHQ)是RAD51的關(guān)鍵肽片段[11]。本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成BRCA1846-871五突變肽9條，通過(guò)熒光光譜法和圓二色光譜法學(xué)研究BRCA1846-871及其五突變肽與RAD51181-200的相互作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Fmoc-Rink Amide-MBHA樹(shù)脂、Fmoc-AA-OH氨基酸、1-羥基-7-氮雜苯并三氮唑(HOAt)、2-(7-氮雜苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)、茚三酮均購(gòu)自上海浙江昂拓有限公司。N,N二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、哌啶、苯甲硫醚、三氟乙酸(TFA)、乙二硫醇、苯酚、乙醚均為分析純，購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。pH=7.4 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液。HPLC-1260型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司。LCQ Fleet型號(hào)離子阱質(zhì)譜儀：美國(guó)賽默飛世爾公司。Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)：美國(guó)安捷倫公司。MOS-500圓二色譜儀：法國(guó)Bio-logic公司。

1.2 BRCA1846-871五突變肽的設(shè)計(jì)和篩選

CABS-dock方法是一種蛋白受體與多肽柔性對(duì)接的研究方法，利用該程序構(gòu)建多肽-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型(http://biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSdock/)。首先從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載RAD51蛋白的結(jié)構(gòu)(ID：1N0W)，借助CABS-dock獲得BRCA1846-871- RAD51復(fù)合物結(jié)構(gòu)，BRCA1846-871的結(jié)構(gòu)通過(guò)輸入其一級(jí)結(jié)構(gòu)肽序(表1)得到。參數(shù)設(shè)置全部默認(rèn)。受體蛋白和肽序經(jīng)過(guò)CABS-dock柔性對(duì)接，按照相應(yīng)的算法篩選，獲得10個(gè)最終的模型，并對(duì)這10個(gè)模型進(jìn)行全原子重建。根據(jù)配體與受體之間結(jié)合的吉布斯自由能(ΔGbind)能量越低，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定的原則，篩選出最理想的復(fù)合物模型[12]。結(jié)合文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道出的BRCA1846-871片段中五個(gè)活性位點(diǎn)(Y856、K862、R866、Q867、P871)，使用DS軟件計(jì)算平臺(tái)(Discovery Studio 2017 R2)對(duì)該復(fù)合物模型中的BRCA1846-871片段肽進(jìn)行五突變?cè)O(shè)計(jì)[13]。

1.3 多肽的合成

本文以Fmoc-Rink-amide-MBHA樹(shù)脂為載體，以HATU、HOBT為縮合劑，DIPEA為活化劑，使用Fmoc保護(hù)固相合成法合成BRCA1846-871及其五突變肽和RAD51181-200。以RAD51181-200為例，合成多肽的步驟如下：稱(chēng)量Fmoc-Rink-Amide-MBHA樹(shù)脂(1.5 g)加入合成容器中，加入DMF(10 mL)并用氮?dú)夤拇?5 min，再用20% 哌啶/DMF(10 ml)脫除Fmoc保護(hù)基20 min，用DMF和甲醇交替洗滌(2×10 mL)。茚三酮溶液檢測(cè)是否存在游離的氨基。稱(chēng)量Fmoc-AA-OH(4倍于樹(shù)脂)、HOBt、HBTU，用10 mL DMF溶解，并加入450 μL DIPEA活化3 min。將該溶液加入肽合成容器中氮?dú)夤拇? h。茚三酮溶液檢測(cè)是否偶聯(lián)成功，配制含有下一個(gè)Fmoc-AA-OH氨基酸的偶聯(lián)溶液。重復(fù)循環(huán)偶聯(lián)和脫保護(hù)步驟，直到偶聯(lián)20個(gè)氨基酸殘基。以三氟乙酸∶硫代乙醇∶硫代異唑∶水∶苯酚=82.5∶5∶5∶5∶2.5比例配制切割試劑，磁力攪拌使肽鏈從樹(shù)脂上切割下來(lái)。砂芯漏斗過(guò)濾至100 mL冰乙醚溶液中使樣品析出。以5 000 r·min-1速度離心5 min，棄上清液，重復(fù)離心3次，自然晾干得到白色粗品肽。

1.4 目標(biāo)多肽的分離純化和質(zhì)譜表征

1.4.1 目標(biāo)多肽的分離純化

用超純水和乙腈以一定比例溶解粗肽并過(guò)濾，使用半制備高效液相色譜(RP-HPLC)等度洗脫分離純化粗品肽。等度洗脫條件：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；色譜柱為 Agilent Zorbax 300 SB-C 18 (9.4 mm×250 mm，5 μm )；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量100 μL；流動(dòng)相：(A)含0.1%三氟乙酸的水、(B)含0.1%三氟乙酸的乙腈；40% B等度洗脫25 min。收集出峰時(shí)溶液，冷凍干燥得到純品肽。

1.4.2 目標(biāo)多肽的質(zhì)譜表征

用超純水和乙腈以一定比例配制2 g/L粗肽溶液，有機(jī)系濾膜過(guò)濾，150～2 000 (m/z) 范圍內(nèi)使用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)檢測(cè)。檢測(cè)條件：檢測(cè)模式為正離子；鞘氣流速：20 psi；掃氣流速：5 psi；噴霧電壓：4.5 kV；套管透鏡電壓：110 V；毛細(xì)管電壓：35 V；毛細(xì)管溫度：275 ℃。

1.5 BRCA1846-871及其五突變肽與RAD51181-200的相互作用研究

1.5.1 熒光光譜法

配制100 mL 0.1 mmol·L-1RAD51181-200溶液，含有不同濃度BRCA1846-871及其五突變肽的測(cè)試樣品溶液各10 mL，濃度分別為0，3，6，9，12，15 μmol·L-1，靜置15 min充分反應(yīng)。激發(fā)波長(zhǎng)為275 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為280～400 nm，狹縫寬度均為10 nm，采用10 mm光程的石英比色皿。將受體RAD51181-200溶液換作50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)，配制不同濃度配體溶液作為空白對(duì)照，其余參數(shù)設(shè)置不變，重復(fù)3次。

1.5.2 圓二色光譜法

配制100 mL 0.1 mmol·L-1RAD51181-200溶液，含有不同濃度BRCA1846-871及其五突變肽的測(cè)試溶液各10 mL，濃度分別為0、0.1 mmol·L-1，靜置15 min充分反應(yīng)。狹縫寬度0.5 nm，步長(zhǎng)1 nm，光程10 mm，掃描速度60 nm·min-1，波長(zhǎng)掃描范圍為200～260 nm。同時(shí)配制含相同濃度配體的溶液10 mL，用Tris-HCl緩沖溶液溶解，作為空白對(duì)照減少配體自身二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，所有設(shè)置參數(shù)不變，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 BRCA1846-871五突變肽的設(shè)計(jì)和篩選

本文通過(guò)計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)BRCA1846-871片段中的五個(gè)活性位點(diǎn)(Y856、K862、R866、Q867、P871)進(jìn)行突變，根據(jù)理論計(jì)算結(jié)果參數(shù)ΔGbind(binding Gibbs free energy)進(jìn)行排序，篩選出與RAD51181-200相互作用較好的五突變肽，ΔGbind越小，配體與受體的親和力越強(qiáng)[14]。如表1所示，篩選9條BRCA1846-871五突變肽，肽序中加粗的字母代表發(fā)生突變的活性位點(diǎn)。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，P2和P9兩條突變肽只有第866位氨基酸不同，該活性位點(diǎn)的氨基酸改變有可能對(duì)二者與RAD51181-200的結(jié)合自由能和相互作用產(chǎn)生影響。同時(shí)，通過(guò)計(jì)算目標(biāo)多肽的Pc值和平均親水性綜合判斷多肽的水溶性。Pc值代表形成無(wú)序卷曲的貢獻(xiàn)值，平均親水性根據(jù)多肽序列中殘基的親/疏水值得到。Pc值在1～0.9之間表示肽在DMF、DMSO等極性溶劑中部分溶解，平均親水性在0～1之間說(shuō)明多肽水溶性一般，需要添加助溶劑或超聲。

2.2 目標(biāo)多肽的RP-HPLC 純化、分析和質(zhì)譜表征

使用Fmoc固相合成法合成11條目標(biāo)多肽，將其溶解成濃度為10 g/L的樣品溶液，有機(jī)系濾膜過(guò)濾，RP-HPLC純化和分析，ESI-MS表征[15]。所有目標(biāo)多肽經(jīng)過(guò)RP-HPLC純化，純度均超過(guò)93%。

所有的多肽樣品的實(shí)測(cè)質(zhì)荷比(m/z)均與理論值保持一致。質(zhì)荷比1 111.42為RAD51181-200(理論相對(duì)分子質(zhì)量為 2 220.02 g·mol-1) [M+2H]2+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 559.83和1 039.92為BRCA1846-871(理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 115.49 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 577.58和1 052.00為P1 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 152.45 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 576.25和1 051.67為P2 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 149.49 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 606.17為P3 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 209.48 g·mol-1) [M+2H]2+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 601.92和1 068.58為P4 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 200.51 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 598.92和1 066.33為P5 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 193.55 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 552.42和1 035.50為P6 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 101.51 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 581.42和1 055.00為P7 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 159.50 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 590.92和1 061.25為P8 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 178.54 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰；質(zhì)荷比1 601.00和1 067.75為P9 (理論相對(duì)分子質(zhì)量為 3 198.51 g·mol-1) [M+2H]2+和[M+3H]3+對(duì)應(yīng)的多電荷離子峰。

2.3 BRCA1846-871及其五突變肽與RAD51181-200相互作用的熒光光譜分析

熒光光譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于配體與主體相互作用的研究中，具有超高的靈敏度，能夠直觀展現(xiàn)熒光強(qiáng)度的變化，通過(guò)計(jì)算可提供許多重要參數(shù)，例如，猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等[16-17]。配體多肽與受體多肽相互作用，會(huì)使受體多肽的熒光增強(qiáng)或猝滅。熒光增強(qiáng)可能是由配體熒光與受體熒光的疊加導(dǎo)致，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生相互作用。熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。

由圖1可知，P6對(duì)RAD51181-200沒(méi)有猝滅作用，其余配體隨著濃度的增加，303 nm處受體RAD51181-200熒光強(qiáng)度逐漸降低，且配體濃度越大，受體RAD51181-200熒光強(qiáng)度下降越明顯。這說(shuō)明除P6以外的其他配體均與受體相互作用且發(fā)生猝滅。另外，P1、P2、P3和P9這四條五突變多肽在350 nm處有強(qiáng)熒光，所以這四條配體加入到受體中后就會(huì)存在強(qiáng)干擾熒光，需要扣除配體本身的熒光。猝滅類(lèi)型可進(jìn)一步確定。

假設(shè)猝滅劑BRCA1846-871及其突變肽與熒光分子RAD51181-200屬于動(dòng)態(tài)猝滅，利用Stern-Volmer方程(1)計(jì)算雙分子猝滅速率常數(shù)Kq[18]。

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中，F(xiàn)0和F分別為受體RAD51181-200未加入和加入配體BRCA1846-871及其五突變肽時(shí)的熒光強(qiáng)度；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，L·mol-1；Q為配體的濃度，mol·L-1；Kq為猝滅速率常數(shù)， L·mol-1·s-1；τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光基團(tuán)的平均壽命，10-8s。以最大吸收波長(zhǎng)303 nm處F0/F為縱坐標(biāo)，Q為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，如圖2所示，斜率即為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv和Kqτ0，如果Kq值大于最大碰撞猝滅速率常數(shù)2×1010L·mol-1·s-1，則說(shuō)明假設(shè)不成立，即屬于靜態(tài)猝滅[19]。

根據(jù)熒光數(shù)據(jù)擬合BRCA1片段配體與RAD51181-200片段受體相互作用的Stern-Volmer 曲線圖，如圖2所示。通過(guò)圖2每條擬合線的斜率計(jì)算得出Ksv和Kq的值，結(jié)果如表2所示，除配體P6以外。9條配體多肽對(duì)受體RAD51181-200的猝滅速率常數(shù)Kq值都大于2×1010L·mol-1·s-1，說(shuō)明發(fā)生靜態(tài)猝滅。對(duì)于靜態(tài)猝滅，BRCA1片段配體與RAD51181-200受體間的結(jié)合常數(shù)K值和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n通過(guò)Lineweaver-Burk方程-雙對(duì)數(shù)方程(2)得出。

lg[(F0-F)/F]=logK+nlg[Q]

(2)

式中，K為配體與受體間的結(jié)合常數(shù)，L·mol-1；n為每摩爾受體RAD51181-200的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。以lg[(F0-F)/F]為縱坐標(biāo)，lg[Q]為橫坐標(biāo)作雙對(duì)數(shù)圖，結(jié)果如表2所示。由表可知，不同配體與受體RAD51181-200的結(jié)合強(qiáng)度存在差異，三條五突變肽即P1 (4.17×104L·mol-1)、P4 (7.61×104L·mol-1)和P5 (1.19×104L·mol-1)與受體RAD51181-200片段的結(jié)合常數(shù)在104～106L·mol-1范圍內(nèi)，剩余六條五突變配體即BRCA1846-871(1.67×103L·mol-1)、P2 (4.56×101L·mol-1)、P3 (4.76×103L·mol-1)、P7 (3.38×103L·mol-1)、P8 (3.97×103L·mol-1)和P9 (5.19×103L·mol-1)的結(jié)合常數(shù)均不在104～106L·mol-1范圍內(nèi)。通過(guò)對(duì)比P2和P9肽序發(fā)現(xiàn)，二者只有第866位氨基酸不同，結(jié)合常數(shù)卻有非常大的差別，這說(shuō)明第866位氨基酸的改變有可能影響整條肽鏈的結(jié)構(gòu)，從而影響與RAD51181-200片段受體的相互作用。由結(jié)合位點(diǎn)n可知，所有的配體BRCA1片段與受體RAD51181-200片段都有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

圖1 BRCA1846-871突變肽存在或不存在時(shí)RAD51181-200的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of RAD51181-200 in the absence or presence of BRCA1846-871 mutants

圖2 RAD51181-200與BRCA1846-871及其五突變肽發(fā)生熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線Fig.2 Stern-Volmer plots for fuorescence quenching of RAD51181-200 by BRCA1846-871 or mutants

表2 Stern-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv，猝滅速率常數(shù)Kq，結(jié)合常數(shù)K及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

2.4 BRCA1846-871及其五突變肽與RAD51181-200相互作用的圓二色光譜分析

圓二色光譜是一種特殊的吸收譜，具有靈敏度高、樣品需求量低、測(cè)試樣品相對(duì)分子質(zhì)量范圍寬、速度快等優(yōu)點(diǎn)，主要用于研究多肽、蛋白質(zhì)、多糖和DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化[20]。本文通過(guò)測(cè)定固定濃度的BRCA1片段配體加入后，受體RAD51橢圓度的變化，來(lái)研究配體對(duì)受體RAD51二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)多肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)的圓二色譜特征是在208 nm和222 nm處有兩個(gè)負(fù)的特征峰，形狀為“W”型[18]。β-折疊在195 nm為正峰，在215 nm為負(fù)峰。

如圖3所示，在220 nm附近存在一個(gè)明顯的負(fù)特征峰，這應(yīng)該是由RAD51181-200受體同時(shí)含有α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊或β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)造成的。加入配體BRCA1846-871及其五突變肽后，受體RAD51181-200負(fù)吸收峰的峰形和位置發(fā)生改變。由圖3可知，P2和P8三條五突變肽對(duì)RAD51181-200受體的橢圓度幾乎沒(méi)有影響；P1、P3、P5、P6、P7和P9六條五突變肽的加入，使RAD51181-200受體的橢圓度略微的上升；P4對(duì)RAD51181-200受體影響最大，不僅使RAD51181-200受體的橢圓度上升，而且使其特征峰發(fā)生了紅移，這可能是因?yàn)镻4的加入改變了RAD51181-200受體周?chē)挠H疏水微環(huán)境。我們使用CD Pro程序計(jì)算RAD51181-200受體的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量變化，結(jié)果如表3所示。P1、P4和P5三條五突變肽使RAD51181-200受體的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降最明顯，從60.5%分別下降到35.7%、36.3%和36.4%。RAD51181-200受體的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降說(shuō)明配體通過(guò)非共價(jià)作用力與受體產(chǎn)生相互作用。α-螺旋結(jié)構(gòu)含量變化可能是由RAD51181-200受體的氫鍵網(wǎng)絡(luò)發(fā)生變化造成的，這說(shuō)明RAD51181-200受體的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，所以RAD51181-200受體的修復(fù)功能也可能會(huì)受到影響。BRCA1846-871突變成P1后理化性質(zhì)全部改變(未列出)，所以對(duì)RAD51181-200受體二級(jí)結(jié)構(gòu)影響影響也比較大。其次是BRCA1846-871、P3、P6、和P9四條五突變肽對(duì)RAD51181-200受體的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量有較大有影響，從60.5%分別下降到56.3%、55.6%、55.6%和54.6%。比較而言，P2、P7和P8三條五突變肽加入后，RAD51181-200受體的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量變化不太明顯，從60.5%分別下降到58.1%、58.1%和58.3%。

圖3 BRCA1846-871及其五突變肽加入前后RAD51181-200的圓二色光譜圖Fig.3 Circular dichroism spectra of RAD51181-200 in the presence of the fixed concentration of BRCA1846-871 mutants

表3 BRCA1846-871及其五突變肽配體加入前后 RAD51181-200受體的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量

3 結(jié)論

采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、篩選出理論上與RAD51相互作用較強(qiáng)的9條BRCA1846-871五突變肽，通過(guò)固相合成法制備目標(biāo)多肽，反相高效液相色譜分離、純化得到純度大于93%的目標(biāo)多肽，ESI-MS表征表明各目標(biāo)多條的相對(duì)分子質(zhì)量正確。利用圓二色光譜法和熒光光譜法研究BRCA1846-871及其9條五突變肽與RAD51181-200的相互作用。圓二色光譜結(jié)果顯示，P1、P4和P5對(duì)RAD51181-200受體的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響較大。熒光光譜結(jié)果顯示，P1、P4和P5在室溫下與受體RAD51181-200的相互作用較強(qiáng)。綜合光譜分析結(jié)果可知，五突變肽P4與RAD51181-200相互作用最強(qiáng)。