基于點(diǎn)擊反應(yīng)合成雙生物活性分子的研究

朱乾貴，王天然，于博然，肖 猱

(首都醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，北京100069)

點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)是由2001年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者美國(guó)化學(xué)家SHARPLESS首次提出的[1]。應(yīng)用最普遍的一類是由Cu(I)催化疊氮化物與端炔化物的加成反應(yīng)(CuAAC)，可生成1,2,3-三唑五元環(huán)化合物[2-4]。由于點(diǎn)擊反應(yīng)自身具備著很多優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物雜質(zhì)少、反應(yīng)條件溫和、具有高度專一性、反應(yīng)過程受到的干擾小和能在水或各種有機(jī)溶劑中發(fā)生等，因此得到了越來越廣泛的關(guān)注[5-7]。

釕(II)配合物可作為DNA探針或是作為抗腫瘤藥物使用，其結(jié)構(gòu)直接影響應(yīng)用效果[6-9]。釕(II)配合物的配體多為二吡啶和三吡啶衍生物，但二吡啶或三吡啶相連的功能基團(tuán)種類有限。FLOOD等[10]曾報(bào)道2-(4-取代-1,2,3-三唑)亞甲基吡啶(tapy)可取代二吡啶，2,6-二(4-取代-1,2,3-三唑)亞甲基吡啶(bitapy)可取代三吡啶，ULRICH和他的合作者以及一些科研工作這也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)[11]。同時(shí)，含有bitapy結(jié)構(gòu)的化合物分子已在活性酶抑制劑、抗腫瘤藥物、生物活性物質(zhì)熒光探針等領(lǐng)域發(fā)揮積極作用[12-14]。這一發(fā)現(xiàn)使得釕(II)配體的種類得到了極大的豐富和拓展[15]。

本研究結(jié)合之前的研究成果[16-19]，應(yīng)用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，采用溫和的合成路線，成功合成了兩類結(jié)構(gòu)可控的bitapy配體分子。選取兩種結(jié)構(gòu)明顯有差異

的疊氮化物四乙?；?β-D-疊氮代葡萄糖和齊多夫定(3′-疊氮-3′-脫氧胸苷)為原料，與2,6-二乙炔基吡啶(DEP)發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)后制備了含生物活性的配體分子。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

附帶DL-400型循環(huán)冷卻器的R-1001-VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，WFH-204B型手提式紫外燈：上海精科實(shí)業(yè)有限公司，核磁共振波譜儀(300 MHz)：美國(guó)布魯克公司，三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)沃特世公司。

1.1.2 試劑

三甲基乙炔基硅，2,6-二溴吡啶，抗壞血酸，五水硫酸銅，無水硫酸鈉，乙二胺四乙酸(EDTA)，氨水，2,3,4,6-四乙酰氧基-α-D-吡喃葡萄糖溴化物(TAGP-Br)，齊多夫定(AZT)，氘代試劑等試劑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶、甲醇、二氯甲烷等試劑購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司；實(shí)驗(yàn)過程所用水為去離子水。

1.2 化合物的合成

1.2.1 合成2,6-二((三甲基硅基)乙炔基)吡啶(2,6-bis((trimethylsilyl)ethynyl)pyridine, BTEP)

1.2.2 合成2,6-二乙炔基吡啶(2,6-diethynylpyridine, DEP)

向一個(gè)300 mL的燒瓶中加入2,6-二((三甲基硅基)乙炔基)吡啶(2.7 g, 10.0 mmol)，TBAF/四氫呋喃(1 mol·L-1, 10.0 mL, 10.0 mmol)，THF (120 mL)和甲醇(4 mL)。將所得混合物在室溫下攪拌30 min后倒入蒸餾水停止反應(yīng)。經(jīng)二氯甲烷萃取后的有機(jī)層以鹽水洗滌，用無水硫酸鈉(Na2SO4)干燥后過濾。旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)填有硅膠的柱色譜洗脫(正己烷/二氯甲烷，體積比為1/1)得2,6-二乙炔基吡啶，除去洗脫液后產(chǎn)物為乳白色固體。產(chǎn)量：1.01 g，產(chǎn)率：79.4%。1H NMR (CDCl3, 300 MHz)δ: 7.66 (t, 1H,J= 15.62 Hz), 7.45 (d, 2H,J= 7.80 Hz), 3.17 (s, 2H)。ESI-MS (m/z): 128.0 [DEP + H+]+(C9H6N+的理論值: 128.0)。

1.2.3 合成疊氮化物2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl azide (TAGP-N3)

TAGP-N3可根據(jù)前期報(bào)道的操作步驟合成得到[20-21]。在無水DMF (25 mL)中加入2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl bromide (TAGP-Br) (5.0 g, 12.2 mmol)和NaN3(1.2 g, 18.5 mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)8 h，反應(yīng)通過TLC監(jiān)測(cè)(二氯甲烷/乙酸乙酯, 體積比為3/1)，直到原料完全消失。待反應(yīng)完全后，用蒸餾水(50 mL)稀釋，并用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。將有機(jī)相經(jīng)無水Na2SO4干燥、過濾并旋蒸至干燥，所得白色固體產(chǎn)物待下一步反應(yīng)。產(chǎn)量：4.1 g，產(chǎn)率：90.1%。1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz)δ: 5.23 (t, 1H,J= 18.85 Hz), 5.11 (t, 1H,J= 19.34 Hz), 4.99 (t, 1H,J= 18.30 Hz), 4.65 (d, 1H,J= 8.84 Hz), 4.31～4.15 (m, 2H), 3.83～3.78 (m, 1H), 2.05 (q, 12H,J= 27.87 Hz);13C NMR (75 MHz, CDCl3)δ: 170.69, 170.20, 169.40, 169.29, 88.02, 74.15, 72.73, 70.77, 68.02, 61.78, 20.79, 20.64。

1.2.4 合成2-ethynyl-6-(1-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridine (TAGP-etapy)

在燒瓶中加入2,6-二乙炔基吡啶(0.6 g, 4.8 mmol)，五水硫酸銅(0.4 g, 0.8 mmol)，抗壞血酸(0.7 g, 4.0 mmol)，用適量的DMF溶解后加入TAGP-N3(1.2 g, 3.2 mmol)。室溫反應(yīng)5 h TLC檢測(cè)，待反應(yīng)結(jié)束后，加入少量的EDTA和適量氨水。然后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中用乙酸乙酯和蒸餾水萃取，保留有機(jī)層。將有機(jī)層經(jīng)無水Na2SO4干燥，過濾，旋干。用柱層析分離純化(乙酸乙酯/石油醚，體積比為5/1)除去2,6-二乙炔基吡啶，隨后以流動(dòng)相乙酸乙酯/石油醚(體積比為2/1)洗脫可得到純產(chǎn)物，除去流動(dòng)相后得白色固體產(chǎn)物。產(chǎn)量：1.2 g，產(chǎn)率：75.0%。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ: 9.13 (s, 1H), 8.08 (d, 1H,J= 7.80 Hz), 7.97 (t, 1H,J= 15.62 Hz), 7.57 (d, 1H,J= 7.59 Hz), 6.45 (d, 1H,J= 9.14 Hz), 5.83 (t, 1H,J= 18.67 Hz), 5.63 (t, 1H,J= 19.03 Hz), 5.26 (t, 1H,J= 19.54 Hz); 4.44～4.41 (m, 1H), 4.17～4.14 (m, 3H), 2.05 (q, 12H,J= 28.15 Hz);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ: 170.10, 169.62, 169.43, 168.71, 149.81, 147.19, 141.77, 138.15, 126.84, 122.90, 119.67, 84.19, 82.81, 80.62, 73.32, 71.99, 70.38, 67.57, 62.00, 30.69, 20.52, 20.42, 20.28, 19.94。

1.2.5 合成2-(1-(2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)-6-(1-(2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)pyridine (TAGP-bitapy-TAGP)

1.2.6 合成1-((2R,4S,5S)-5-(hydroxymethyl)-4-(4-(6-(1-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D- glucopyranosyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)pyridin-2-yl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)tetrahydrof-uran-2-yl)-5-methylpyrimidine-2,4(1H,3H)-dione (TAGP-bitapy-AZT)

2 結(jié)果與討論

2.1 雙端炔的合成

2-(三甲基硅基乙炔基)吡啶是制備炔基化合物2,6-二乙炔基吡啶的前體，其合成是以2,6-二溴吡啶為原料，采用易于脫去的三甲基硅烷乙炔作保護(hù)基團(tuán)與2,6-二溴吡啶在低溫下偶聯(lián)的方法合成得到。

2,6-二乙炔基吡啶通過四丁基氟化銨(TBAF)的脫保護(hù)功能與已制備的2-(三甲基硅基乙炔基)吡啶反應(yīng)制得(圖1)。

2.2 雙糖基配體的合成

疊氮化物的制備由相應(yīng)的鹵化物與疊氮化鈉在DMSO或DMF中共熱生成，反應(yīng)過程以雙分子親核取代反應(yīng)反應(yīng)(SN2)進(jìn)行，疊氮化反應(yīng)前的原料為α構(gòu)型，而反應(yīng)之后的產(chǎn)物為β構(gòu)型。

TAGP-bitapy-TAGP分子的合成采用2,6-二乙炔基吡啶(DEP)與疊氮化四乙酰基葡萄糖(TAGP-N3)為原料，利用五水硫酸銅和抗壞血酸鈉為催化劑，在室溫條件下通過點(diǎn)擊反應(yīng)一步可得(圖2)。

2.3 糖基-核苷基分子結(jié)構(gòu)的確定

新型含有雙生物活性分子A-B型化合物TAGP-bitapy-AZT可增加分子與生物體結(jié)合幾率和強(qiáng)度，具備潛在應(yīng)用價(jià)值。反應(yīng)過程也是應(yīng)用點(diǎn)擊反應(yīng)條件以2,6-二乙炔基吡啶、疊氮化物為原料合成得到。反應(yīng)條件與制備TAGP-bitapy-TAGP類似，所不同的是在一價(jià)銅離子的催化下依次進(jìn)行兩次點(diǎn)擊反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。具體而言，首先使用2,6-二乙炔基吡啶的一個(gè)炔基與疊氮化物TAGP-N3反應(yīng)制備一端含乙炔基的前配體TAGP-etapy，而后以此一端含乙炔基的配體TAGP-etapy繼續(xù)與另一疊氮化物AZT反應(yīng)生成最終的配體TAGP-bitapy-AZT(圖3)。

圖1 2,6-二乙炔基吡啶的合成Fig.1 Synthesis of 2,6-diethynylpyridine

圖2 TAGP-N3和TAGP-bitapy-TAGP的合成Fig.2 Synthesis of TAGP-N3 and TAGP-bitapy-TAGP

圖3 TAGP-etapy和TAGP-bitapy-AZT的合成Fig.3 Synthesis of TAGP-etapy and TAGP-bitapy-AZT

3 結(jié)論

主要通過點(diǎn)擊反應(yīng)，采用具備生物活性的葡萄糖及核苷衍生物為原料，與DEP反應(yīng)合成了具有bitapy結(jié)構(gòu)的兩類新型化合物TAGP-bitapy-TAGP和TAGP-bitapy-AZT，為制備均臂型及雜臂型金屬配合物提供了條件。