HPLC法測(cè)定中藥袋中4種抗氧劑的含量及其遷移

王小艷，張 濤，李 鵬

(安陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，安陽(yáng) 455000)

中藥袋主要由聚乙烯(polyethylene，PE)和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)材料組成[1]，具有質(zhì)輕、穩(wěn)定性好、使用方便等特點(diǎn)。由于PE和PET材料在成型和使用過(guò)程中受到熱、光、射線等因素的影響而容易老化，因此在生產(chǎn)過(guò)程中常常會(huì)加入抗氧劑予以改善、抑制或延緩其老化過(guò)程?？寡鮿┯忻鞔_的生物毒性，對(duì)人體肝、脾、肺等均有不良影響。其相對(duì)分子質(zhì)量較小，分散在聚乙烯結(jié)構(gòu)中，可能溶入藥液，產(chǎn)生非預(yù)期的不良反應(yīng)，甚至可與藥物反應(yīng)降低療效[2]。目前，國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有中藥袋中抗氧劑的檢測(cè)方法，也沒(méi)有考慮抗氧劑的遷移量[3]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定中藥袋中抗氧劑1010、330、1076、168的含量及對(duì)遷移量進(jìn)行監(jiān)測(cè)[4-10]，以期為中藥袋的質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

抗氧劑1010、168(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)MKBS0720V、MKBL6586V，純度98%)；抗氧劑330[梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)HBENN-NK，純度95.0%]；抗氧劑1076(北京百靈威科技有限公司,批號(hào)L740Q63，純度99%)；甲醇、乙腈(J.T.Baker公司，色譜純)；其他試劑均為分析純；超純水為 Molecular 純水機(jī)制備；樣品購(gòu)于市場(chǎng)。

1.2 儀器

e2695高效液相色譜儀、2998 PDA檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；XS205DU電子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)；RV10 control旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(艾卡儀器設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters ZORBAX eclipse XDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇為流動(dòng)相；采用Waters 2998 PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm，流速1.0 ml/min，柱溫25 ℃。色譜圖見(jiàn)圖1。

1:抗氧劑1010；2:抗氧劑330；3:抗氧劑1076；4:抗氧劑168

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品抗氧劑1010、330、1076、168適量，以二氯甲烷與乙腈(1∶1)為溶劑，制備成每 1 ml 分別含10 μg抗氧劑1010、100 μg抗氧劑330、100 μg抗氧劑1076、100 μg抗氧劑168的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1提取試驗(yàn)供試品溶液的配制

將中藥袋剪成1 cm×1 cm的小塊，精密稱取7.5 g，加入乙腈80 ml，精密稱定。水浴回流5 h，冷卻后用乙腈補(bǔ)足重量，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，用乙腈溶解并定容至2 ml量瓶中，濾過(guò)，即得。

2.3.2遷移試驗(yàn)供試品溶液的配制

取本品，按照標(biāo)示量分別裝入90 ℃的模擬浸泡液(水、pH 3.5緩沖液、pH 8.0緩沖液)，保溫30 min后放至室溫。分別于0、3和7天取樣。取1藥袋，將模擬浸泡液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，用乙腈溶解并定容至1 ml量瓶中，濾過(guò)，作為遷移試驗(yàn)供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系

分別取4種抗氧劑系列對(duì)照品溶液，在“2.1”色譜條件下，精密吸取10 μl，分別注入色譜儀中，測(cè)定色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？芍糠N抗氧劑在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見(jiàn)表1。

表1 4種抗氧劑線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次。測(cè)得抗氧劑1010、330、1076、168峰面積的RSD分別為1.5%、1.6%、1.8%、0.8%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一樣品溶液10 μl，分別在0、2、4、6、8、10和12 h進(jìn)樣，測(cè)得抗氧劑1010、1076、168峰面積的RSD分別為1.4%、0.6%、1.3%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果樣品中抗氧劑1010、1076、168含量的RSD分別為0.2%、0.1%、0.5%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品6份，精密稱定7.5 g，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(抗氧劑1010、330、1076、168濃度分別為0.1017、1.012、1.000和1.055 mg/ml)3 ml，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下分析。結(jié)果抗氧劑1010、330、1076、168的平均加樣回收率分別為82.4%、84.5%、91.6%和95.7%，RSD分別為0.5%、1.1%、1.5%和1.3%。

2.9 檢測(cè)限和定量限

取混合對(duì)照品溶液用二氯甲烷與乙腈(1∶1)逐步稀釋，按照“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄4種抗氧劑的信噪比，以信噪比為3∶1時(shí)的進(jìn)樣濃度作為檢測(cè)限，以信噪比為10∶1時(shí)的進(jìn)樣濃度作為定量限，各抗氧劑的檢測(cè)限和定量限濃度如表2所示。

表2 4種抗氧劑的檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測(cè)定

2.10.1提取試驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果

取中藥袋8批，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下分析，以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 中藥袋中抗氧劑的含量測(cè)定結(jié)果 μg/g

2.10.2遷移試驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果

取中藥袋8批，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下分析，以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。測(cè)定結(jié)果表明，8批中藥袋中均未檢出抗氧劑330，檢測(cè)到抗氧劑1010、1076、168有不同程度的遷移，樣品放置7天后抗氧劑的遷移量沒(méi)有明顯增加。

表4 遷移試驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果 ng/cm2

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取抗氧劑1010、330、1076、168對(duì)照品適量，加入二氯甲烷和乙腈(1∶1)制成適當(dāng)濃度的溶液，以二氯甲烷和乙腈(1∶1)為空白，在190～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明抗氧劑1010、330、1076、168都在274 nm處有最大吸收，干擾少且穩(wěn)定。

3.2 提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)以甲苯、乙腈∶四氫呋喃(1∶1)、乙腈為溶劑進(jìn)行提取，以抗氧劑1010、330、1076、168回收的含量分別為指標(biāo)，觀察回流(1、2、5和6 h)、超聲(20、30和40 min)不同的提取方法，結(jié)果表明乙腈為提取溶劑時(shí)，回流5.0 h，抗氧劑1010、330、1076、168含量均達(dá)到最高且能提取完全。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了水-四氫呋喃-乙腈、乙腈-水、乙腈、甲醇為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以甲醇為流動(dòng)相的色譜圖基線更平穩(wěn)，峰型和分離度均較好，所以確定其為流動(dòng)相。

3.4 遷移試驗(yàn)浸泡液的選擇

中藥合劑的pH一般為3.5～7.0，又考慮到中藥液在放置過(guò)程中微生物的滋長(zhǎng)易導(dǎo)致酸敗現(xiàn)象，所以選擇水、pH 3.5緩沖液和pH 8.0緩沖液作為浸泡液模仿灌裝和使用。

3.5 遷移試驗(yàn)提取方法的選擇

分別用Cleanert PEP-SPE固相萃取小柱吸收提取液，并用乙腈洗脫，收集洗脫液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液近干，用乙腈溶解并定容；用正己烷提取浸泡液，收集正己烷提取液，用氮?dú)獯蹈桑和槎ㄈ?。?種提取方法對(duì)4種抗氧劑做加樣回收，發(fā)現(xiàn)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液近干，用乙腈溶解并定容回收率最高。

3.6 抗氧劑330的情況分析

本次收集的樣品中檢測(cè)到抗氧劑1010、1076、168，未檢測(cè)到抗氧劑330?？寡鮿?010、1076、168在不同的提取液有所遷移，所以建議在生產(chǎn)加工中藥袋時(shí)，選用合格的藥品包裝材料。這樣才能降低抗氧劑帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，保障人民群眾用藥安全。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC法測(cè)定中藥袋中4種抗氧劑含量的檢測(cè)方法，4種抗氧劑在一定濃度范圍內(nèi)呈線性，回收率、精密度和重復(fù)性等均達(dá)到要求?？蓾M足藥包材中抗氧劑1010、330、1076、168的定性與定量分析，為藥包材的質(zhì)量控制提供一定的依據(jù)。