HPLC法在《中國藥典》的應(yīng)用與展望

柯 穎，洪小栩

(1 中國藥科大學(xué)，南京 210009；2 國家藥典委員會，北京 100061)

高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法是20世紀(jì)60年代初期在經(jīng)典柱色譜基礎(chǔ)上創(chuàng)立的一種分離分析技術(shù)，汲取了氣相色譜(GC)法的發(fā)展經(jīng)驗。與經(jīng)典色譜法相比，HPLC法具有分離效率高、分析時間短、檢測靈敏度高等優(yōu)勢[1]。HPLC法在藥品研發(fā)和質(zhì)量控制等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，涉及藥品檢驗的各個方面，如藥品鑒別、雜質(zhì)控制、含量測定等。HPLC法首次收載于《中國藥典》1985年版，在藥品質(zhì)控中的應(yīng)用日益廣泛，目前已成為藥品安全性、有效性控制最重要的檢測方法。

1 基本原理與類型

HPLC法與經(jīng)典液相色譜法有所不同，基本原理是以液體為流動相，在高壓下利用不同組分與固定相和液體流動相的吸附能力、離子交換作用以及分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)分離。根據(jù)保留時間的不同，對樣品各組分進(jìn)行定性定量分析[2]。典型的高效液相色譜儀一般具備儲液器、高壓泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等主要部件。

HPLC法按照固定相和流動相的相對極性可分為正相色譜(normal phase chromatography)和反向色譜(reversed phase chromatography)。兩者區(qū)別見表1。

表1 正相色譜法與反向色譜法的區(qū)別

另外，為適應(yīng)不同有機(jī)化合物的特性，保證絕大多數(shù)有機(jī)化合物的分離分析，裝有不同類型填料的色譜柱與相對應(yīng)的流動相形成了不同的分離機(jī)制。按照分離過程的機(jī)制可分為分配色譜(partition chromatography)、吸附色譜(absorption chromatography)、離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)、分子排阻色譜(size exclusion chromatography,SEC)、親和色譜(affinity chromatography,AC)。

2 HPLC法在歷版《中國藥典》的應(yīng)用

《中國藥典》1985年版首次新增了HPLC法，將其收入附錄。同時，在二部7個品種的含量測定方法中應(yīng)用了HPLC法，分別為丙酸睪丸素注射液、葉酸、葉酸片、苯丙酸諾龍注射液、黃體酮注射液、維生素D3注射液、醋酸氟輕松軟膏。按品種數(shù)量統(tǒng)計，HPLC法在歷版《中國藥典》中的應(yīng)用情況見表2和圖1。

表2 歷版《中國藥典》HPLC法收載情況 個

圖1 歷版《中國藥典》HPLC法收載數(shù)量趨勢

從表2和圖1可以看出，從《中國藥典》1985年版到2020年版的發(fā)展可分為4個時期：1985～2000年為起步期，HPLC法應(yīng)用品種數(shù)目增多但是增長緩慢；2000～2005年為上升期，HPLC法應(yīng)用品種數(shù)目增長明顯；2005～2015年為快速發(fā)展期，增長最為明顯的是《中國藥典》2010年版；2015～2020年為平穩(wěn)期，HPLC法應(yīng)用品種數(shù)目增多但是趨于平穩(wěn)。

值得一提的是，在HPLC法的快速發(fā)展期間，《中國藥典》2010年版一部收載品種2165種，采用HPLC法的有1214種，占總數(shù)的56%；二部收載品種2271種，采用HPLC法的有1366種，占總數(shù)的60%。從最新頒布實施的《中國藥典》2020年版來看，一部、二部采用HPLC法的品種分別占總數(shù)的66%和72%。由此可見，當(dāng)前HPLC法已成為《中國藥典》中最常用的檢測方法。

按檢測項目統(tǒng)計，HPLC法在歷版《中國藥典》中的應(yīng)用情況見表3、表4和圖2、圖3。

表3 HPLC法在歷版《中國藥典》一部不同檢測項目中的應(yīng)用品種數(shù)量 個

表4 HPLC法在歷版《中國藥典》二部不同檢測項目中的應(yīng)用品種數(shù)量 個

圖2 HPLC法在歷版《中國藥典》一部不同檢測項目應(yīng)用情況

圖3 HPLC法在歷版《中國藥典》二部不同檢測項目應(yīng)用情況

自《中國藥典》1985年版收載HPLC法開始，該法最先應(yīng)用于化學(xué)藥品的含量測定，并于《中國藥典》1990年版首次增加了HPLC法用于5種中藥品種含量測定。HPLC法在藥品質(zhì)量控制方面的應(yīng)用不斷普及，主要用于藥品安全性、有效性的質(zhì)控項目。在化學(xué)藥品中，應(yīng)用最普遍的檢測項目是鑒別、有關(guān)物質(zhì)和含量測定；在中藥中，應(yīng)用最普遍的檢測項目是鑒別和含量測定；在生物制品中，主要用于蛋白質(zhì)純度測定。

化學(xué)藥品除了關(guān)注鑒別和含量測定項目以外，對有關(guān)物質(zhì)的控制也格外注重。有關(guān)物質(zhì)是指能影響藥物純度、降低主成分含量的雜質(zhì)，主要包括生產(chǎn)過程中帶入的起始原料、中間體、聚合體、副反應(yīng)產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等[3]?；诎踩钥紤]，有關(guān)物質(zhì)研究是化學(xué)藥品質(zhì)量研究的關(guān)鍵項目，HPLC法常用于化學(xué)藥品的有關(guān)物質(zhì)含量測定。從圖3可以看出，采用HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)含量的化學(xué)藥品品種數(shù)量增長迅速?；瘜W(xué)藥品的鑒別試驗也越來越多地采用HPLC法替代紅外測定法。在含量測定方面，HPLC法更是首選的“黃金法”。

中藥材和飲片作為臨床用中成藥和湯劑的原料，其安全性和有效性一直是熱點話題。針對這兩方面的問題，每一版《中國藥典》的修訂，都把工作重點放在進(jìn)一步加強中藥材和飲片的專屬性鑒別和質(zhì)量控制上。中藥材和飲片所含成分結(jié)構(gòu)多樣復(fù)雜，為鑒別和含量測定帶來巨大挑戰(zhàn)，給方法學(xué)的建立提出了更嚴(yán)格的要求[4]。面對挑戰(zhàn)，HPLC法憑借其穩(wěn)定性和分離的可靠性，為中藥材和飲片鑒別和含量測定提供了技術(shù)手段，成為突破傳統(tǒng)中藥質(zhì)量控制理念、推進(jìn)質(zhì)量控制現(xiàn)代化的有力工具。

生物制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要強調(diào)安全性、有效性和可接受性。由于受到純度的影響，藥效不能充分發(fā)揮，甚至對人體產(chǎn)生毒副作用。因此，生物制品在精制后，要求檢查純度是否符合規(guī)定。過去對生物大分子的分離主要依賴免疫電泳法，但有一定的局限性。HPLC法逐漸被開發(fā)用于生物制品的純度測定，以其重復(fù)性好、自動化程度高、檢測限低(達(dá)ng或pg級別)、回收率高且不失活等特點，成為生物制品純度分析的重要工具。

經(jīng)過多年的發(fā)展，HPLC法的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，涉及各個藥品品種領(lǐng)域，主要用于鑒別、有關(guān)物質(zhì)檢測和含量測定。以往多數(shù)采用薄層色譜法進(jìn)行藥物鑒別，優(yōu)勢在于使用簡便且成本較低，但是為了尋求更高的準(zhǔn)確性，最終被HPLC法替代。采用HPLC法進(jìn)行含量測定的優(yōu)勢在于分離效率高，可應(yīng)用于高沸點、熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析，從而替代繁瑣的滴定分析法。

3 技術(shù)展望

隨著各國藥品標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，以及對分離純化技術(shù)的不斷探索，使得HPLC法發(fā)展迅速。HPLC法以其高效、準(zhǔn)確性好、操作自動化等特點，已經(jīng)普遍運用于藥物分析檢測的各個領(lǐng)域[5]。HPLC法最大的優(yōu)勢在于藥品的定量檢查。目前，HPLC法的發(fā)展主要體現(xiàn)在兩個方面：一方面，通過革新技術(shù)仍保持其在定量領(lǐng)域的優(yōu)勢，要求降低色譜柱顆粒度、加快色譜分離效率；另一方面，為了克服其在定性領(lǐng)域的劣勢，通過與其他分析技術(shù)聯(lián)用，如質(zhì)譜(MS)、飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS)、核磁共振(NMR)等。

3.1 超高效液相色譜法

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)是在HPLC法的理論基礎(chǔ)上，應(yīng)用了新型小顆粒填料及裝填技術(shù)、超高壓液相色譜泵、低擴(kuò)散、低交叉污染的自動進(jìn)樣器以及快速檢測手段等全新技術(shù)。與傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)相比，能獲得更高的柱效，其分離效率、靈敏度和分辨率都有很大的提高。因此，適合于中藥復(fù)雜成分的分離分析，在中藥研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。

李垚等[6]采用UPLC法測定丹參不同部位中丹參素、原兒茶酸等14種水溶性成分的含量，建立的UPLC法分離度好、靈敏度高，可實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。陳冉等[7]采用UPLC法測定了鮮川芎和川芎藥材中6種活性成分的含量。郭社民等[8]建立UPLC法，采用Acquity UPLC HSS T3色譜柱，可同時測定參杞通脈膠囊中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。

3.2 高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)

高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)。其檢測原理是樣品通過液相色譜系統(tǒng)后由色譜柱分離，隨后質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)荷比分開，經(jīng)檢測器后得到色譜圖，分析后可得知色譜峰中所有化學(xué)物質(zhì)的相對分子質(zhì)量信息，可用于識別分子結(jié)構(gòu)以及純度的檢查，適用于極性強、揮發(fā)度低、相對分子質(zhì)量大且熱不穩(wěn)定的混合有機(jī)物體系[9]。HPLC-MS法的優(yōu)點：高靈敏度、對樣品的選擇性高以及能對多種樣品成分進(jìn)行定性定量分析[10]。但同時也存在一定的局限性，如復(fù)雜樣品基質(zhì)的干擾物會對分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，而基質(zhì)效應(yīng)很難消除。HPLC-MS的應(yīng)用非常廣泛，為分子生物學(xué)、化合物的表征及鑒定、定量和定性分析、治療藥物監(jiān)測中的自動免疫分析、臨床化學(xué)和毒理學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強有力的檢測手段。

近些年發(fā)展的液相色譜-光譜技術(shù)包括高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-PDA)、高效液相色譜-圓二色(HPLC-CD)、高效液相色譜-核磁共振(HPLC-NMR)等。HPLC-PDA法適用于大多數(shù)有紫外吸收的物質(zhì)，可同時檢測多個波長，因此可以一次性得到樣品所有組分的信息，十分方便，但是對流動相選擇有一定的限制[11]。鑒于圓二色檢測器的選擇性較高，只對具有旋光活性的物質(zhì)有響應(yīng)，因此HPLC-CD法在復(fù)雜基質(zhì)中手性化合物的分析以及在手性化合物絕對構(gòu)型的測定中有很好的應(yīng)用前景[12]。例如，采用HPLC-CD法分析甲霜靈的對映體純度[13]。HPLC-NMR法在分析未知雜質(zhì)時，無需純品作對照，且沒有破壞性，充分發(fā)揮了其專屬性強、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點，能做到快速分離、結(jié)構(gòu)鑒定并且對樣品進(jìn)行定性定量分析。

4 小結(jié)

HPLC法在《中國藥典》中應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，充分說明了該法在藥品檢測領(lǐng)域的重要地位。在《中國藥典》一部(中藥)部分，HPLC法主要用于特征圖譜的定性分析、指紋圖譜的半定量分析以及多成分的含量測定。在《中國藥典》二部(化學(xué)藥品)部分，HPLC法主要用于鑒別、有關(guān)物質(zhì)與含量測定，對于復(fù)雜樣品體系，必要時采用固相萃取柱進(jìn)行前處理和富集。在《中國藥典》三部(生物制品)部分，HPLC法主要用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和純度分析。

現(xiàn)代HPLC法的發(fā)展將在技術(shù)革新、發(fā)展檢測器、創(chuàng)新色譜填料技術(shù)、完善理論等方面做出努力，促使HPLC法及其相關(guān)方法在各個領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，進(jìn)一步穩(wěn)固HPLC法的主流分析地位，具有廣闊的發(fā)展前景。