谷氨酰胺預(yù)處理對失血性休克大鼠HSP70 水平及耐缺血時間的影響

郭永軍 關(guān)永東 鄧素貞 戴慧暉 麥長鳳 吳志云 楊方勇

失血性休克是創(chuàng)傷及重大手術(shù)患者常見而嚴(yán)重的并發(fā)癥，如果不積極有效地治療，將會導(dǎo)致一系列嚴(yán)重后果如敗血癥、急性呼吸窘迫綜合征、多臟器功能衰竭綜合征，甚至死亡。本研究旨在通過觀察不同谷氨酰胺給藥時間預(yù)處理后對失血性休克大鼠HSP-70 水平、缺血耐受時間及炎癥因子的影響，尋找重大手術(shù)時提高機體抗打擊能力、減少炎癥反應(yīng)引起的繼發(fā)損傷的途徑及在短醫(yī)缺藥時如何提高患者對失血性休克的耐受能力方法。

1 實驗資料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性大鼠80 只，體重200-210 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，在恒溫、恒濕條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按隨機數(shù)字表法分為對照組，實驗組1、實驗組3、實驗組7，每組20 只。實驗組3、實驗組7 分別于失血性休克模型制備3 天前，7 天前予以L-谷氨酰胺（購自MedChemExpress）灌胃針注入，用量：1 mg/（kg.次），每天3次。實驗組1 僅為術(shù)前2 小時喂1 次，對照組為正常一般飼養(yǎng)，不添加藥物。

1.2 方法實驗 當(dāng)日術(shù)前2 h 禁食，自由飲水。用異氟烷對大鼠進行吸入麻醉。大鼠麻醉后仰臥固定于鼠尾血壓計操作平臺上，右側(cè)股靜脈插管并接注射器以供放血，肝素鈉50 U/100 g 全身肝素化，大鼠尾部置于鼠尾血壓計測壓裝置內(nèi)。于術(shù)畢血壓穩(wěn)定10 min 后開始放血，在10 min 內(nèi)將平均動脈血壓（MAP）降至40 mmHg，并調(diào)整失血量維持MAP 于40 mmHg，對照組與實驗組按分組每組要求分別在血壓降至40 mmHg 即刻（0）、0.5 h、2 h 后，迅速放血處死大鼠（每組各時間點各處死5 只），同時留取血液樣本。每實驗組剩5 只大鼠觀察由休克模型建立至自行死亡時間，具體操作如下：休克模型建立血壓穩(wěn)定半小時后，撤除異氟烷，置于大鼠籠內(nèi)自然蘇醒、觀察，起始2 h 監(jiān)測一次血壓，如血壓超過監(jiān)測范圍，予以再次放血，觀察6 h后，每12 h 監(jiān)測一次血壓，直至大鼠死亡。該動物實驗于2021 年3 月在清遠市人民醫(yī)院動物實驗中心完成。

1.3 指標(biāo)檢測 抽取股靜脈血2 mL，注入含EDTA 抗凝管中，靜置20 min 后置入德國Sigma 3-30 K 高速冷凍離心機4℃2 000 r/min 離心20 min 分離出血漿，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血漿HSP?70 的表達水平及IL?6 水平。HSP?70試劑盒購自SAB Signalway Antibody。IL?6 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用（±s）表示，采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同組別HSP70，IL-6水平及生存時間比較 見表1。

3 討 論

失血性休克是創(chuàng)傷導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一，目前通常采用快速灌注液體的方法以迅速恢復(fù)循環(huán)血容量治療失血性休克。但目前尚缺乏在短醫(yī)缺藥時如何提高患者對失血性休克的耐受能力，從而為挽救患者生命爭取時間的方法［1］。熱休克蛋白（HSP）又稱應(yīng)激蛋白，它是機體細胞受到高熱、饑餓、缺氧、缺血等刺激后誘導(dǎo)激活HSP 基因產(chǎn)生的一種具有高效表達、高度保守特性的蛋白質(zhì)，它對機體防御應(yīng)激因素的損害起著重要作用［2，3］。

表1 不同組別HSP70，IL?6 水平及生存時間的比較（n=20，±s）

表1 不同組別HSP70，IL?6 水平及生存時間的比較（n=20，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與實驗組1 比較，#P＜0.05；與實驗組3比較，&P＜0.05。

組別對照組實驗組1實驗組3實驗組7 HSP70（ng/L）1.09±0.19 1.41±0.25 0.87±0.16 0.77±0.25 IL?6（ng/L）30.36±7.58 31.56±6.64 12.57±2.90*#10.46±2.99*#生存時間（h）48.40±3.42 52.40±3.52 62.60±3.50*79.20±4.47*#&

谷氨酰胺，學(xué)名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，是谷氨酸的酰胺。L-谷氨酰胺是蛋白質(zhì)合成中的編碼氨基酸，哺乳動物非必需氨基酸，在體內(nèi)可以由葡萄糖轉(zhuǎn)變而來。谷氨酰胺可用于治療胃及十二指腸潰瘍、胃炎及胃酸過多，也用于改善腦功能。 研究表明：應(yīng)激及損傷時HSP 具有以下生物學(xué)特性：（1）提高細胞對應(yīng)激原的耐受性；（2）起到分子伴侶的作用，與新生、未折疊、錯誤折疊或聚焦的蛋白質(zhì)結(jié)合，使某些蛋白質(zhì)解離，減少產(chǎn)生不溶性聚集物，加速正確的肽鏈折疊，促進某些變性蛋白的降解和清除；（3）抗細胞凋亡作用，細胞內(nèi)HSP70 水平的升高可通過阻斷信號通路，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白激酶38（PK38）和JNK 激活，從而減少細胞凋亡［4］。（4）免疫功能：HSP70 還有結(jié)合細胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體，激活蛋白激酶C 及蛋白酶活性、ATP 水解、生成過氧化物歧化酶（SOD）等功能，使細胞自衛(wèi)，并維持其生物學(xué)特性，參與免疫反應(yīng)和抑制炎癥反應(yīng)；（5）抗氧化應(yīng)激作用：機體應(yīng)激時氧自由基生成增多，HSP70 抑制產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，通過反饋抑制作用減少氧自由基的產(chǎn)生，還可提高內(nèi)源性過氧化酶水平，從而加快氧自由基的清除［5］。（6）谷氨酰胺具有上調(diào)HSP70表達作用，減少缺血再灌注損傷對心肌的損害功能［6］；谷氨酰胺通過誘導(dǎo)HSP70 的表達，減少炎性介質(zhì)IL?6 等的表達，抑制炎癥反應(yīng)生成和抑制體內(nèi)過氧化物產(chǎn)生，提高LPS 休克血管低反應(yīng)性，可能有助于LPS 休克病人的治療［7］。本研究結(jié)果顯示：HSP70 在各實驗組之間，及與對照組的比較無明顯差異，P＞0.05；IL?6 水平及生存時間隨著喂養(yǎng)谷氨酰胺時間的延長而逐漸降低，實驗組與對照組間及實驗組間均有明顯差異，P＜0.05。既往研究表明谷氨酰胺可以上調(diào)LPS 休克大鼠心臟HSP70 表達，與本研究無明顯差異不符，可能與檢測標(biāo)本不同有關(guān)。

綜上所述，谷氨酰胺預(yù)處理對大鼠血漿HSP70 水平無影響，但有下調(diào)失血性休克大鼠IL?6 水平的作用，可能會抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，可以提高大鼠的耐缺血時間。