利福平通過(guò)抑制蛋白激酶R 活化調(diào)節(jié)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

鄧嘉強(qiáng) 井秀娜 林淡鈺 卜璐璐 陳穎 陶恩祥

帕金森?。≒D）是常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病，主要以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性和路易小體的形成為病理特征。目前PD 確切的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，最近研究表明持續(xù)存在的免疫反應(yīng)參與了帕金森病的發(fā)病機(jī)制［1］。神經(jīng)炎癥在死后PD 患者大腦中仍存有明顯的病變特征，NLRP3炎癥小體是PD 病理過(guò)程中發(fā)揮主要調(diào)控作用的炎癥小體，異常聚集的α?syn 能激活NLRP3炎癥小體誘發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失［2］。因此，抑制NLRP3炎癥小體的激活，可作為治療PD 的重要方案。

有研究發(fā)現(xiàn)，在抑制PKR 活化后可以抑制NLRP3炎癥小體的激活和IL?1β 的成熟和分泌［3］。利福平可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的激活來(lái)減輕小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥毒性［4］，并且利福平可以抑制PERK?eIF2α?ATF4 通路緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元［5］。PKR 與PERK 都是eIF2α 系列分子，siRNA 靶向PERK 能抑制PKR 活化［6］。因此，我們猜測(cè)利福平能通過(guò)抑制PKR 活化減輕神經(jīng)炎癥發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證利福平抑制PKR 活化緩解神經(jīng)炎癥，我們觀察了利福平對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)下BV2細(xì)胞內(nèi)p?PKR、Caspase?1、NLRP3、IL?1β 等蛋白的表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探索了利福平抑制神經(jīng)炎癥發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制，旨在為帕金森病的治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料 DMEM 培養(yǎng)基、D/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco 公司；Rotenone 購(gòu)自美國(guó)APExBio 公司；Rifampicin 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；C16（PKR 抑制劑）購(gòu)自美國(guó)Merck?Millipore 公司；兔抗PKR 抗體購(gòu)自美國(guó)艾菲公司；兔抗phos?phoT446?PKR 抗體購(gòu)自美國(guó)SAB 公司，兔抗IL?1β抗體、兔抗NLRP3抗體、兔抗Caspase?1 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；β?actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)CST 公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司；6 孔Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)小室購(gòu)自Corning 公司。

1.2 主要方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)用D/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1000 r/min 離心5min 棄去上清，細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清（FBS）的D/F12 培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用PBS洗1 遍再更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，用胰蛋白酶消化下來(lái)后，按1∶5 進(jìn)行傳代。（2）實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為5 組，（1）空白對(duì)照組（2）魚(yú)藤酮組（3）利福平組（4）利福平預(yù)處理組（5）C16 預(yù)處理組。

1.3 Western blot 法檢測(cè)利福平預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的p?PKR、PKR、NLRP3、Caspase?1、IL?1β 表達(dá)的影響 各組細(xì)胞按2.2 分組，經(jīng)藥物孵育后，用細(xì)胞裂解液在冰上裂解，12000 r/min 離心30 min 后收集上清。用BCA 蛋白分析試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度。以每組蛋白上樣量為20 μg 進(jìn)行SDS?PAGE 凝膠電泳。取適量的蛋白進(jìn)行蛋白變性、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次。用ECL 發(fā)光液在成像儀中成像顯影，用ImageJ 軟件對(duì)獲得的蛋白條帶圖像進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞共培養(yǎng) 將重懸的BV2 細(xì)胞按3×105個(gè)/孔的密度接種在共培養(yǎng)皿的下室，用含有10%血清的D/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)SH?SY5Y 細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度接種在共培養(yǎng)皿的上室，待細(xì)胞貼壁后按上述實(shí)驗(yàn)分組情況進(jìn)行藥物孵育處理。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 胰酶消化收集共培養(yǎng)皿上室中SH?SY5Y 細(xì)胞，離心棄掉上清后，再用2 mL PBS 清洗細(xì)胞，1000 r/min，離心5 分鐘，設(shè)置1 個(gè)空白對(duì)照和5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入5 μL V450?A 試劑混勻，于室溫避光反應(yīng)10-15 min 后，再加入10 μL PI 試劑混勻，半小時(shí)內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 我們進(jìn)行了3 個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，所有的實(shí)驗(yàn)條件被重復(fù)或三次測(cè)試，應(yīng)用Graph?pad Prism 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和作圖，定量數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One?way ANOVA）統(tǒng)計(jì)方法，當(dāng)P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 利福平可以抑制PKR 磷酸化 見(jiàn)圖1。

圖1 利福平可以抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中PKR 活化

2.2 利福平可通過(guò)抑制PKR 活化調(diào)節(jié)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥 見(jiàn)圖2。

2.3 利福平可通過(guò)抑制PKR 活化減輕神經(jīng)炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 見(jiàn)圖3。

圖2 利福平通過(guò)抑制PKR 活化對(duì)NLRP3、IL?1β、Caspase?1 等蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

各種致病因素刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放各種促炎癥因子加劇神經(jīng)元變性、丟失，在A53T 基因突變的PD 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)部位大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，且出現(xiàn)PD 相關(guān)的異常行為學(xué)特征［7］。相比健康人群，PD 患者的腦脊液和血液等生物液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL?1β、NLRP3炎癥小體表達(dá)水平明顯升高［8］。因此，阻斷神經(jīng)炎癥可以延緩腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性、壞死，對(duì)PD 患者的治療和預(yù)防起著重要的作用。

炎癥小體的激活可以引導(dǎo)先天免疫系統(tǒng)對(duì)致病刺激的反應(yīng)和致病物質(zhì)的產(chǎn)生，NLRP3炎癥小體是近幾年來(lái)研究最廣泛的一種，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活釋放各種細(xì)胞因子，這些炎性物質(zhì)又進(jìn)一步激活NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致惡性循環(huán)形成［9］。因此，抑制NLRP3激活來(lái)緩解神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，為神經(jīng)退行性疾病治療提供新的指導(dǎo)。

圖3 利福平通過(guò)抑制PKR 活化減輕小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥誘導(dǎo)的SH?SY5Y 細(xì)胞凋亡

在PD 患者腦組織切片中發(fā)現(xiàn)退化神經(jīng)元中磷酸化PKR 表達(dá)水平上調(diào)，促使多巴胺神經(jīng)元變性和丟失，PKR 可以調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活、Caspase?1 的活化和IL?1β 的成熟，惡化神經(jīng)炎癥反應(yīng)，而抑制PKR 活化能有效減輕相應(yīng)的炎癥反應(yīng)［11］。由此可知，PKR 活化對(duì)NLRP3炎癥小體激活在神經(jīng)退行性疾病中起重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，魚(yú)藤酮組發(fā)現(xiàn)p?PKR、NLRP3、IL?1β、Caspase?1 等蛋白的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，而利福平組無(wú)改變。利福平預(yù)處理組或C16 預(yù)處理組，以上蛋白的表達(dá)水平得到逆轉(zhuǎn)。

PKR 活化調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體依賴性細(xì)胞因子的釋放。由此可見(jiàn)，抑制PKR 活化可減輕NLRP3誘發(fā)的神經(jīng)炎癥，為慢性神經(jīng)退行性疾病的治療和進(jìn)展提供了新的方向。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，用接受不同處理的BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞與SH?SY5Y 細(xì)胞共培養(yǎng)24 小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。與空白組相比，魚(yú)藤酮組細(xì)胞凋亡水平明顯升高，利福平組細(xì)胞凋亡水平?jīng)]有變化。與魚(yú)藤酮組相比，利福平預(yù)處理組或C16 預(yù)處理組，細(xì)胞凋亡水平出現(xiàn)反轉(zhuǎn)。

綜上所述，PKR 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性病變過(guò)程中起著重要作用。利福平減輕小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞損傷，這可能與利福平調(diào)控PKR 活化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究擴(kuò)展了利福平對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，若能進(jìn)一步明確利福平抑制過(guò)表達(dá)PKR 誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活的調(diào)控機(jī)制，將為新型抗PD 藥物研發(fā)提供新的指導(dǎo)。