彌散加權(quán)成像評(píng)價(jià)大鼠復(fù)蘇后腦損傷研究

劉志鋒 葉浩翊 阮耀欽 伍志華 楊正飛

腦損傷是心臟驟停（cardiac arrest，CA）幸存者死亡的主要原因，隨著心肺復(fù)蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）技術(shù)革新，死亡率逐年降低［1］。然而，仍然有超過(guò)75%的幸存者出現(xiàn)腦損傷而致殘［2］。早期評(píng)估CA/CPR 后腦損傷及預(yù)測(cè)患者預(yù)后對(duì)臨床調(diào)整治療策略十分重要。研究［3］發(fā)現(xiàn)核磁共振彌散加權(quán)成像（diffusion?weighted magnetic resonance imaging，DWI）可以評(píng)估CA/CPR 后腦水腫預(yù)測(cè)患者預(yù)后，然而DWI 檢查的最優(yōu)時(shí)間點(diǎn)仍然沒(méi)有形成共識(shí)，是否存在某一些時(shí)間點(diǎn)不適用于評(píng)估腦水腫？基于這一臨床科學(xué)問(wèn)題，我們?cè)O(shè)計(jì)了一組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立大鼠CA 模型分別在CA/CPR 后恢復(fù)自主循環(huán)（return of spontaneous circulation，ROSC）6 及24 小時(shí)后行DWI 檢查，對(duì)比分析兩個(gè)檢查時(shí)間點(diǎn)對(duì)評(píng)估CA/CPR 后腦水腫的價(jià)值，為臨床提供實(shí)驗(yàn)性研究數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 心臟驟停模型分組及制作 將20 只體重為（506±13）g 的雄性SD 大鼠放在無(wú)菌房間內(nèi)飼養(yǎng)，該房間在恒溫（20-22℃）下光照和黑暗均12 小時(shí)。將大鼠隨機(jī)分為sham 組（n=6）、ROSC6h 組（n=7）及ROSC24 組（n=7），采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射45 mg/kg 麻醉大鼠使用自制心肺復(fù)蘇參考先前研究方法制作大鼠窒息CA 模型［4］。假手術(shù)組動(dòng)物進(jìn)行了相同的手術(shù)，但沒(méi)有誘導(dǎo)窒息。本研究為前瞻性對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究，本研究采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均取得廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明，本實(shí)驗(yàn)得到了廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 儀器與方法 所有大鼠模型掃描均使用GE 1.5T MRI 成像儀（GE 1.5T Signa HDi，美國(guó)）和橫向1.5T 8 通道大鼠專用線圈（CG?MUC44?H150?AG，上海晨光有限公司）進(jìn)行。各組大鼠均通過(guò)腹膜內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉（10 mg/kg）進(jìn)行麻醉，將大鼠模型固定在線圈中，保持俯臥姿勢(shì)行DWI 序列橫斷位掃描。TR 3000 ms，TE 125 ms，矩陣128×192，F(xiàn)OV 80 mm×80 mm，層厚2.5 mm，層間距0.8 mm，信號(hào)激勵(lì)次數(shù)8 次，采集時(shí)間1.5分鐘。

1.3 各組大鼠全腦ADC 值測(cè)量 各組大鼠全腦ADC 值由兩名具有5 年以上工作經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)生獨(dú)立測(cè)量，并取兩名測(cè)量者平均值。選擇大鼠全腦（橫斷面經(jīng)海馬包括小腦及大腦的最大層面）作為感興趣的區(qū)域（ROI）。使用GE 后處理工作站Functool 軟件測(cè)量大鼠全腦ADC 值。

1.4 免疫組化方法 將大鼠斷頭取腦組織用4%中性緩沖甲醛固定24 小時(shí)后制作成石蠟組織塊，石蠟組織以4 μm 厚切片，防脫載玻片撈片，使用MaxVisionTMHRP 免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行水通道蛋白4（aquaporin?4，AQP4）染色，具體步驟按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 運(yùn)用SPSS 25 軟件包（SPSS，Chi?cago，IL）對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。連續(xù)變量計(jì)量資料以（±s）表示，分類變量以百分比（%）表示，各組間的比較使用方差分析（one?way ANOVA），若數(shù)據(jù)方差齊時(shí)兩兩比較采用L?S?D 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3 法檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本研究共使用了20 只SD 雄性大鼠，14 只大鼠接受了CPR，12 只大鼠成功ROSC（12/14，85.7%）其中2 只未能ROSC（2/14，14.3%），其余6 只大鼠接受了假手術(shù)。

2.1 各組大鼠的基線特征和CPR 特征 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠基線生理參數(shù)及CPR 特征（±s）

表1 各組大鼠基線生理參數(shù)及CPR 特征（±s）

注：ROSC=return of spontaneous circulation；各組間比較P 值均＞0.05。

變量體重（g）心率（次/分鐘）呼氣末CO2分壓（mm Hg）平均動(dòng)脈壓（mm Hg）動(dòng)脈血pH 值氧分壓（mm Hg）動(dòng)脈血乳酸（mmol/L）窒息時(shí)間（分鐘）心臟按壓時(shí)間（分鐘）sham（n=6）516±19 395±27 42±2 122±7 7.32±0.04 93±12 1.1±0.3--ROSC6h（n=6）514±21 403±30 41±3 119±14 7.41±0.05 94±13 1.2±0.4 10.3±0.9 3.8±1.2 ROSC24 h（n=6）517±20 409±28 44±3 121±11 7.39±0.03 92±14 1.2±0.3 10.8±1.1 3.9±1.7

2.2 各組大鼠的全腦DWI 分析 見(jiàn)圖1、表2。

2.2 各組大鼠的AQP4 免疫組化分析 見(jiàn)圖2。圖2. 各組大鼠AQP4 抗體免疫組化DAB 顯色（放大倍數(shù)200×）。A、sham 組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AQP4抗體表達(dá)陰性；B、ROSC6h 組神經(jīng)細(xì)胞AQP4 抗體表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性；C、ROSC24h 組神經(jīng)細(xì)胞AQP4 抗體表達(dá)陽(yáng)性。

圖1 各組大鼠模型DWI 圖像。Sham 組（A）、ROSC6h 組（B）及ROSC24 h 組（C）DWI 圖像均未見(jiàn)異常信號(hào)

表2 各組大鼠全腦ADC 值比較

3 討 論

圖2 各組大鼠AQP4 抗體免疫組化DAB 顯色（放大倍數(shù)200×）

CA/CPR 后的腦缺血-再灌注損傷是臨床預(yù)后的主要決定因素，它的起因是由于腦氧輸送的減少，引起一系列復(fù)雜的病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血腦屏障破壞，腦代謝異常和腦水腫等［5］。在這項(xiàng)研究中，比較了大鼠CA/CPR 后在ROSC 6 h 和24 h的全腦ADC 值。結(jié)果表明，大鼠CA/CPR 后出現(xiàn)腦水腫，ADC 值在復(fù)蘇早期（ROSC6h）可以評(píng)估腦水腫，但是在復(fù)蘇后期（ROSC24h）評(píng)估腦水腫受限。DWI 利用水分子擴(kuò)散來(lái)成像，提供基于腦生理狀態(tài)的信息，可以檢測(cè)并定量評(píng)估CA/CPR 后腦水腫的嚴(yán)重程度及預(yù)測(cè)患者神經(jīng)預(yù)后［3］。Park JS 等［6］回顧分析36 例院外CA 患者6 小時(shí)內(nèi)的DWI 檢查，發(fā)現(xiàn)6 個(gè)月后神經(jīng)預(yù)后不良的患者全腦ADC 值明顯下降，均小于700×10-6mm2/s，結(jié)果提示CA 早期出現(xiàn)嚴(yán)重的腦細(xì)胞毒性水腫，ADC 值下降可預(yù)測(cè)患者神經(jīng)預(yù)后不良。Hirsch KG 等［3］，對(duì)51 例在CA 后7 天內(nèi)接受DWI 檢查的患者分析，結(jié)果顯示神經(jīng)預(yù)后不良的患者腦部ADC ＜650×10-6mm2/s，靈敏度為63%，特異性96%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94%。本研究DWI 結(jié)果顯示大鼠復(fù)蘇早期（ROSC6h）ADC 值明顯下降，免疫組化結(jié)果顯示AQP4 抗體表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，提示大鼠腦部出現(xiàn)嚴(yán)重的腦水腫，表明ADC 值在復(fù)蘇早期可以評(píng)估腦水腫。隨著復(fù)蘇時(shí)間的推移，復(fù)蘇后期（ROSC24h）大鼠腦部ADC 值回升，與sham 組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，然而免疫組化結(jié)果顯示復(fù)蘇后期（ROSC24h）AQP4 抗體表達(dá)仍為陽(yáng)性，但是表達(dá)程度較復(fù)蘇早期（ROSC6h）下降，結(jié)果表明在復(fù)蘇后期（ROSC24h）評(píng)估腦水腫可能受限。Tang Z 等［7］對(duì)比分析豬CA 模型ROSC6h 與72 h 的全腦ADC值，發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)蘇時(shí)間推移出現(xiàn)全腦ADC 值回升的現(xiàn)象，與本研究結(jié)果相近。隨著復(fù)蘇后腦血流量的升高，大腦供血供氧恢復(fù)，短期內(nèi)腦內(nèi)細(xì)小血管自身調(diào)節(jié)功能逐步恢復(fù)，清除了短暫堆積的代謝物質(zhì)后恢復(fù)了細(xì)胞功能所需的內(nèi)環(huán)境，故細(xì)胞毒性水腫好轉(zhuǎn)，ADC 值回升；另外，CA/CPR 后血液復(fù)流，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞再灌注損傷，加劇血腦屏障受損而通透性增加，大量的自由水經(jīng)受損的血腦屏障從血管進(jìn)入血管外細(xì)胞外間隙，導(dǎo)致血管源性腦水腫，血管外細(xì)胞外間隙內(nèi)彌散運(yùn)動(dòng)快的自由水增多，導(dǎo)致彌散系數(shù)增加，故復(fù)蘇后期（ROSC24h）ADC 值上升［8］。

本實(shí)驗(yàn)存在幾點(diǎn)不足之處：第一，本實(shí)驗(yàn)使用健康的大鼠，不能模擬人類真實(shí)的疾病狀態(tài)；第二，本研究三組大鼠樣本量較少；第三，本實(shí)驗(yàn)只研究了ROSC6h 和24 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，研究更多的ROSC 時(shí)間點(diǎn)有利于了解CA/CPR 后腦水腫演變。綜上所述，ADC 值可用于CA/CPR 后復(fù)蘇早期（ROSC6h）腦水腫評(píng)估，但是在復(fù)蘇后期（ROSC24h）評(píng)估腦水腫受限。

致謝

本組實(shí)驗(yàn)所有大鼠模型均在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院唐萬(wàn)春急危重癥實(shí)驗(yàn)室完成。在此向?qū)嶒?yàn)室全體工作人員表示衷心地感謝！