基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法研究芫花抗炎作用機(jī)制

宗明月,張慶然,王璐瓊,辛 敏,趙 烽

(煙臺大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺 264005)

芫花(DaphnegenkwaSieb.et Zucc.)為瑞香科(Thymelaeaceae)植物,史載于《山海經(jīng)》中山經(jīng),已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床超過2000年,主要分布于我國長江及黃河流域各省[1]。芫花含有多種化學(xué)成分,如黃酮類、木脂素類、香豆素類、瑞香烷型二萜類等[2],研究表明其藥理活性主要包括抗腫瘤[3]、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等[4]。

中藥具有多靶點(diǎn)、多成分的特點(diǎn),簡單的藥理學(xué)方法不能系統(tǒng)地揭示中藥化學(xué)成分在體內(nèi)的作用機(jī)制[5]?？茖W(xué)技術(shù)的發(fā)展、多學(xué)科的相互交叉為中藥藥效評價(jià)提供了高效、快速的方法。靶點(diǎn)篩選借助計(jì)算機(jī)模擬分析、生物信息學(xué)和分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)等,從不同角度預(yù)測藥物發(fā)揮藥效的作用機(jī)制,成為藥效評價(jià)體系不可缺少的一部分[6]。而計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)具有直觀、合理和便捷等特點(diǎn),并逐漸成為中藥與現(xiàn)代化進(jìn)程連接的橋梁,其中分子對接[7]是通過模擬藥物與受體大分子的相互作用,尋找與靶蛋白結(jié)合密切的候選化合物,可以進(jìn)一步明確芫花中主要抗炎藥效物質(zhì),并闡明其藥理作用機(jī)制,優(yōu)選主要抗炎化學(xué)成分及靶點(diǎn)蛋白,為芫花的藥理作用及產(chǎn)品開發(fā)等提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 芫花活性成分的篩選和處理

TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/index.ph)數(shù)據(jù)庫檢索出芫花所含的化學(xué)成分共57個(gè)。根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行初步篩選[8],挑選出口服生物利用度(oral bioavailability, OB)大于30%,類藥性(drug-likenesses, DL)大于0.18的化合物共14個(gè)組成化合物數(shù)據(jù)庫,化合物名稱及具體相關(guān)信息見表1?？诜锢枚仁撬幬镂?、分布、代謝、排泄特性中尤為重要的參數(shù)之一,是表明藥效分子及類藥性的關(guān)鍵指數(shù)。類藥性是指有良好的臨床療效藥物的物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)特性。在Chemdraw中繪制14個(gè)待對接化合物的平面結(jié)構(gòu),見圖1。在SYBYL-X2.0中創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫,將這些化合物導(dǎo)入后進(jìn)行能量最小化處理,使每個(gè)化合物有最穩(wěn)定的構(gòu)象,最后加入到創(chuàng)建的數(shù)據(jù)庫中。

表1 芫花中所含有化學(xué)成分的相關(guān)信息

圖1 芫花中14個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)

1.2 芫花活性成分作用靶點(diǎn)的篩選

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選得到的14個(gè)化合物通過Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)[9]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載14個(gè)化合物的2D結(jié)構(gòu)的SDF文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中, Organism選擇Homo Sapiens,系統(tǒng)默認(rèn)每個(gè)化學(xué)成分輸出前15個(gè)靶標(biāo)蛋白,包括蛋白名稱、基因名稱等信息。

1.3 芫花活性成分作用靶點(diǎn)KEGG通路富集

將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,引用String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,得到靶標(biāo)蛋白所參與的所有途徑,篩選出與靶標(biāo)蛋白顯著參與的途徑(P<0.05),使用R 3.6.3,安裝并引用clusterProfiler包后,進(jìn)行前20條通路的氣泡圖繪制,包括通路名稱、富集因子、富集分析的P值等.

1.4 芫花活性成分與作用靶點(diǎn)的分子對接

采用分子對接軟件SYBYL-X2.0中的Surflex-Dock模塊完成分子對接研究。根據(jù)富集的通路結(jié)果,選取富集到基因數(shù)目最多的抗炎通路中潛在的靶點(diǎn)蛋白。本研究的靶點(diǎn)均從RSCB Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫中獲取。其中下載了fms related receptor tyrosine kinase 3(FLT3,PDB:6IL3)、spleen associated tyrosine kinase(SYK,PDBID:3FQH)、glycogen synthase kinase 3 beta(GSK3B,PDB: 3GB2)、insulin like growth factor 1 receptor(1GF1R,PDBID:3F5P)、epidermal growth factor receptor(EGFR,PDB: 3BEL)、kinase insert domain receptor(KDR,PDBID:2XIR)、erb-b2 receptor tyrosine kinase 2(ERBB2,PDB:3PP0)、interleukin 2(IL2,PDB:1M49)、phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha(PIK3CA,PDB:3ZIM)、phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit delta(PIK3CD,PDB:6PYR)、phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1(PIK3R1,PDB:4A55)、protein kinase C alpha(PRKCA,PDB:4RA4)、protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha(PPP2CA,PDB:3P71)的晶體結(jié)構(gòu)。蛋白晶體前處理及結(jié)合口袋的定義:提取原配體分子,刪除水分子及其非相關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)象,補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基,為蛋白加氫,以原配體分子位置為中心,選擇半徑5埃范圍內(nèi)為活性口袋,其他參數(shù)為默認(rèn)值。

按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分子對接后,分別得到每個(gè)化合物與各靶點(diǎn)蛋白的對接得分Score值, Score值越大,配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。Score 值大于 5.0 表明化合物與靶點(diǎn)蛋白有較好的結(jié)合活性,大于 7.0 表明化合物與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合具有強(qiáng)烈的活性[10]。

1.5 芫花活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

初步篩選得到的芫花活性成分(其中預(yù)測不到靶點(diǎn)以及篩選不到靶點(diǎn)的化合物不考慮)與選取的通路中的潛在靶標(biāo)蛋白輸入到Cytoscape3.7.2網(wǎng)絡(luò)可視化軟件中,構(gòu)建成分-靶點(diǎn)(compound-target,C-T)網(wǎng)絡(luò),基于邊數(shù)、節(jié)點(diǎn)、關(guān)聯(lián)性設(shè)置顏色、大小。

1.6 芫花活性成分與靶點(diǎn)蛋白相互作用分析

LigPlot+是LigPlot的GUI界面化軟件,是一款經(jīng)典的配體與蛋白二維相互作用作圖軟件,可展示配體分子與受體蛋白之間的氫鍵、疏水等相互作用。本研究采用Ligplot 1.4.5 版本,將芫花活性成分與靶標(biāo)蛋白Merg并且以PDB格式保存,導(dǎo)入軟件中,自動(dòng)計(jì)算形成的氫鍵、疏水作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 芫花活性成分作用靶點(diǎn)KEGG通路分析

運(yùn)用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選芫花活性成分的作用靶點(diǎn)蛋白,其中8號化合物羥光刺苞菊內(nèi)酯未預(yù)測到靶點(diǎn)蛋白,其余13個(gè)化學(xué)成分共篩選出195個(gè)靶點(diǎn)蛋白,將重復(fù)出現(xiàn)的靶點(diǎn)蛋白刪除,共篩選得到95個(gè)靶標(biāo)蛋白,使用KEGG通路富集分析得到30條代謝途徑。使用R 3.6.3,安裝并引用clusterProfiler包后輸出前20條顯著通路,通路分析見圖2。

顏色越紅表示顯著性越明顯,氣泡越大表示富集到的基因數(shù)目越多。

2.2 芫花活性成分與作用靶點(diǎn)的分子對接

20條通路中選擇了富集到基因數(shù)目最多的抗炎通路:PI3K-Akt signaling pathway(P< 0.05)。PI3K-Akt通路包含14個(gè)靶點(diǎn)蛋白,其中protein phosphatase 2 regulatory subunit B'alpha(PPP2R5A)沒有原配體,未深入研究。將芫花活性成分與PI3K-Akt通路中除PPP2R5A以外的13個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接。使用對接結(jié)果中的Score 值的大小來評價(jià)配體與受體結(jié)合的穩(wěn)定性,挑選出Score值等于或大于5的化合物。結(jié)果表明木犀草素、槲皮素、山萘酚、羥基芫花素、芫花素、龍膽山酮酚、7-羥基-6-甲氧基-3,7'-雙香豆素、芫根苷、角鯊烯為芫花發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵化學(xué)成分,對接總分大于65(表2)。

表2 活性成分與靶標(biāo)蛋白分子對接打分結(jié)果

2.3 芫花活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

初步篩選得到的芫花活性成分(其中預(yù)測不到靶點(diǎn)以及篩選不到靶點(diǎn)的化合物不考慮)與選取的通路中的潛在靶標(biāo)蛋白輸入到Cytoscape3.7.2網(wǎng)絡(luò)可視化軟件中,構(gòu)建成分-靶點(diǎn)(compound-target,C-T)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)度(degree)的大小篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)及化學(xué)成分,整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的大小與此節(jié)點(diǎn)的度呈正比,即與此節(jié)點(diǎn)相連的邊越多,度越大,節(jié)點(diǎn)也就越大。如圖3所示,EGFR、SYK、KDR芫花調(diào)節(jié)PI3K-Akt通路的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白;木犀草素、山萘酚、羥基芫花素、槲皮素、龍膽山酮酚、芫花素等為芫花調(diào)節(jié)PI3K-Akt通路的關(guān)鍵化學(xué)成分,與分子對接結(jié)果一致。其中,圓圈代表關(guān)鍵靶點(diǎn),菱形代表關(guān)鍵化學(xué)成分。

圖3 化學(xué)成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)模型

2.4 芫花活性成分與靶點(diǎn)蛋白相互作用分析

芫花中關(guān)鍵化學(xué)成分(Score>65)和epidermal growth factor receptor(EGFR)的相互作用分析結(jié)果見表3,結(jié)果顯示木犀草素、槲皮素、山萘酚、羥基芫花素、芫花素與EGFR相互作用有很大的相似性,從表3中可以看出均與Met793、Gln791、Thr790、Lys745、Leu844、Ala743等氨基酸殘基發(fā)生了相互作用,而且氨基酸殘基相對位置相同,氨基酸類型相同(表3),推測這些殘基就是epidermal growth factor receptor(EGFR)的關(guān)鍵氨基酸殘基。

表3 關(guān)鍵化學(xué)成分與EGFR形成的氫鍵及疏水作用

3 討 論

磷酸肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)是生長因子超家族信號傳導(dǎo)過程中的重要分子, 可被多種細(xì)胞因子和理化因素激活,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能[11]。磷酸化的 PI3K 可以通過PDK1/Akt途徑激活 NF-κB并促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá),也可以通過Akt/mTOR途徑促進(jìn) STAT3 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。抑制 PI3K 可以顯著抑制 NF-κB的活化,進(jìn)一步降低iNOS、COX-2、IL-6、IL-1β的表達(dá),從而減輕炎癥[12]。研究表明[13],PI3K及其下游靶標(biāo)Akt的激活對于TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB激活至關(guān)重要。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接相結(jié)合的方法篩選出芫花發(fā)揮抗炎的關(guān)鍵成分及靶點(diǎn),通過相互作用進(jìn)一步明確重要的氨基酸殘基。結(jié)果表明,PI3K-Akt信號通路可能是芫花發(fā)揮抗炎作用的主要信號通路,木犀草素、槲皮素、山萘酚、羥基芫花素、芫花素等是芫花發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵成分,EGFR、SYK、KDR是其發(fā)揮抗炎作用的主要靶點(diǎn)。EGFR 常在腫瘤細(xì)胞過表達(dá),但該受體也廣泛存在表皮細(xì)胞,可刺激表皮細(xì)胞生長,抑制其分化,抑制炎癥并加速創(chuàng)面愈合。磷酸化的EGFR將胞外信號傳入細(xì)胞內(nèi),激活下游一系列多功能化的信號通路,包括Ras/Raf/MEK/MAPK/JAK/STAT和PI3K/AKT,主要參與細(xì)胞的增殖、分化和存活[14]。王莉[15]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),芫花具有良好的抗炎效果,芫花根總黃酮可能是通過抑制早期炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌,以減少炎癥因子PGE2、NO等晚期炎癥因子的產(chǎn)生。越來越多的結(jié)果表明[16],植物化學(xué)成分(如木犀草素)可通過抑制PI3K/Akt途徑減少內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。此外,亦有研究[17]證明槲皮素和山萘酚可以通過抑制脂多糖誘導(dǎo)的STAT-1和NF-κB通路的激活,以及iNOS的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。槲皮素在體外可有效抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖,并抑制膠原的合成和分泌,其機(jī)制可能與槲皮素激活PI3K/Akt/NF-κB信號通路,上調(diào)磷酸化PI3K及Akt表達(dá),進(jìn)而抑制NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[18]。芫花素可以通過降低IKK、IκB和NF-κB的磷酸化水平來抑制NF-κB通路的激活,并下調(diào)iNOS、COX-2和IL-6 mRNA的表達(dá)水平發(fā)揮抗炎作用[19]。以上結(jié)果與本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測相互佐證。并且,本研究基于計(jì)算機(jī)輔助平臺建立了芫花藥理作用靶點(diǎn)快速篩選方法,相對于傳統(tǒng)篩選,節(jié)約了大量時(shí)間和財(cái)力,同時(shí)為芫花藥效評價(jià)提供新思路,為芫花細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供理論支撐。更重要的是,在中藥新藥研究領(lǐng)域建立全新的理念和先進(jìn)的研究手段,可為中藥現(xiàn)代研究提供新思路和新方法。