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    高山松miR171a及其靶基因的鑒定與表達分析

    2021-05-26 16:53:34張雪如王穩(wěn)利邱宗波曾倩倩
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2021年7期
    關鍵詞:熒光定量PCR

    張雪如 王穩(wěn)利 邱宗波 曾倩倩

    摘要:以裸子植物高山松為試驗材料,利用筆者所在實驗室前期構(gòu)建的高山松miRNA數(shù)據(jù),通過生物信息學方法篩選與高山松生長發(fā)育相關的miR171a,并通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增法(RLM-5′RACE)驗證得出,GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)和肌動蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401)的基因為高山松miR171a的靶基因。通過PCR技術(shù)克隆得到的高山松miR171a前體序列可形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),但其成熟序列的堿基保守性較差。系統(tǒng)進化分析顯示,pde-miR171a與裸子植物火炬松的進化關系較近。經(jīng)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),pde-miR171a在高山松莖中的相對表達量最高,其次是在針葉中,而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達量較低,暗示pde-miR171a可以通過調(diào)控靶基因Unigene10015而參與高山松的生長發(fā)育。

    關鍵詞:高山松;miR171;靶基因;熒光定量PCR

    中圖分類號: S718.46文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2021)07-0062-05

    收稿日期:2020-08-05

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31500499);河南省高??萍紕?chuàng)新人才項目(編號:16HASTIT019)。

    作者簡介:張雪如(1996—),女,河南洛陽人,碩士研究生,主要從事植物發(fā)育生物學方面的研究。E-mail:1365655297@qq.com。

    通信作者:邱宗波,博士,教授,主要從事植物分子生物學方面的研究。E-mail:qiuzongbo@126.com。

    microRNA(miRNA)是一類由21~24個核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈小RNA,主要是在轉(zhuǎn)錄后水平介導靶mRNA的降解或翻譯抑制來調(diào)控基因表達[1]。自研究者從秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)第1個 miRNA以來,miRNA一直是研究的熱點[2]。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),miRNAs在高山松(Pinus densata)的生長發(fā)育[3]、杉木種子的萌發(fā)[4]及落葉松體胚的生長發(fā)育和形態(tài)建成等方面起著重要的調(diào)控作用[5]。

    miR171是在植物中最早發(fā)現(xiàn)的miRNAs家族成員之一[6],在擬南芥中有3個miRNA成員,分別是ath-miR171a、ath-miR171b和ath-miR171c[7]。通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增(RNA ligase-mediated 5′ rapid amplification of cDNA ends,簡稱RLM-5′RACE)試驗,研究者發(fā)現(xiàn)水稻中的miR171能介導靶基因OsHAM(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)mRNA的剪切降解,從而促進水稻營養(yǎng)生長向生殖生長的過渡及根尖分生組織穩(wěn)態(tài)的形成[8]。楊樹miR171通過調(diào)控GRAS轉(zhuǎn)錄因子而參與楊樹的生長發(fā)育和光形態(tài)建成的調(diào)控[9]。張力等研究發(fā)現(xiàn),煙草miR171c通過負調(diào)控SCL靶基因TC134811、TC127385,使植物出現(xiàn)頂端優(yōu)勢喪失和莖稈增多等表型[10]。盡管目前關于miR171在多個植物中功能的研究較多,但目前在裸子植物高山松中,miR171的鑒定及其在高山松生長發(fā)育過程中的功能尚不清楚。

    高山松是一種具有重要生態(tài)意義的裸子植物[11]。本研究根據(jù)高山松小RNA高通量測序結(jié)果獲得的miR171a,進行前體序列的克隆與分析。通過在線預測網(wǎng)站獲得 miR171a的靶基因,并通過RLM-5′RACE進行驗證。同時還分析了miR171a及其靶基因在高山松不同組織部位的表達特性,為揭示miR171a在高山松生長發(fā)育中的作用提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    2月齡的高山松幼苗于2019年5月置于溫室中培養(yǎng)(晝—夜生長溫度周期為 25 ℃—18 ℃,光—暗周期為16 h—8 h,相對濕度為65%~70%)。

    1.2 高山松miR171前體序列的克隆及其二級結(jié)構(gòu)預測

    使用植物Concert Plant RNA Reagent (美國Invitrogen公司)從2月齡的高山松幼苗中提取總RNA。從筆者所在實驗室得到的高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中獲得高山松miR171a的前體序列:5′-AAAGAAUGUGAUGUUGGCUAGGCUCAAUCGGAUUGUAACGCCCACGGAAUUUGGUCUUGUGAUCUGAUUGAGCCGUGCCAAUAUCACAUUCUAAC-3′,用Primer 5.0軟件設計特異性引物進行PCR 擴增(表1)。采用Clustalx 2.0軟件,以高梁sbi-miR171a、擬南芥ath-miR171a、油菜bna-miR171a、玉米 zma-miR171a、大豆gma-miR171a、火炬松pta-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、水稻osa-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a的成熟序列為模板進行序列比對。用MEGA 7.0構(gòu)建miR171a前體序列的系統(tǒng)進化樹,通過RNAfold web server在線軟件預測miR171a前體序列的二級結(jié)構(gòu)。

    1.3 高山松miR171a靶基因的預測與切割位點的驗證

    將高山松miR171a的成熟序列提交到靶基因在線預測網(wǎng)站psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)上,以高山松的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫作為靶標,設置期望值為2.5,其余參數(shù)為默認值。將預測到的靶基因比對到GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫中,確定其功能。依據(jù)靶基因的cDNA序列,用Primer 5.0軟件設計用于RLM-5′RACE的引物(表1)。RLM-5′RACE試驗參照孔雷等的方法[12],擴增出的特異產(chǎn)物后進行克隆測序。

    1.4 實時熒光定量PCR

    使用植物Concert Plant RNA Reagent (美國Invitrogen公司)分別提取2月齡高山松幼苗根、莖和針葉的總RNA。用Superscript Ⅱ reverse transcriptase (美國Invitrogen公司)進行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量試驗使用Thunderbird SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本Toyobo公司)。以actin作為miR171a和靶基因Unigene10015的內(nèi)參基因。利用Rotor-Gene 3000型實時PCR擴增儀檢測,每個樣品設3次生物學重復?;蛳鄬Ρ磉_量的測定采用2-ΔΔCT法(C表示循環(huán)數(shù);T表示熒光閾值)[13],將基因在根中的表達水平設成1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pde-miR171a前體序列的擴增及二級結(jié)構(gòu)的預測

    從筆者所在實驗室前期得到的高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中篩選得到高山松miR171a的前體序列,進行引物設計,以高山松基因組DNA為模板進行PCR擴增,得到高山松miR171a的前體序列長度為96 bp(圖1)。用RNAfolder軟件在線分析其二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)高山松pre-miR171a可折疊成典型的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖 2),預測得出其二級結(jié)構(gòu)的最小折疊自由能(minimal folding free energy,簡稱MFE)為-230.74 kJ/mol,最小折疊自由能指數(shù)(minimal folding free energy index,MFEI)為1.28,miR171a的成熟序列(5′-UGAUUGAGCCGUGCCA AUAUC-3′)位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3′端。

    2.2 高山松miR171a成熟序列和前體序列的分析

    對miRBase數(shù)據(jù)庫中不同植物的miR171a成熟序列與高山松miR171a(pde-miR171a)的成熟序列進行比對,發(fā)現(xiàn)除了高梁sbi-miR171a、pde-miR171a的成熟序列完全一致外,其他物種的miR171a如擬南芥ath-miR171a、玉米zma-miR171a、火炬松pta-miR171a、水稻osa-miR171a、油菜bna-miR171a、大豆gma-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a與高山松pde-miR171a的成熟序列間有1個或多個堿基的差異(圖3),表明高山松 pde-miR171a的成熟序列在不同物種中的保守性不高。用MEGA 7.0對毛白楊、玉米、卷柏、高梁、擬南芥、火炬松、大豆、水稻、油菜和高山松的MIR171a共25個成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖4)顯示,不同物種的MIR171前體保守性不高,高山松與火炬松的前體序列聚為一類,二者間的進化關系較近。

    2.3 高山松miR171a靶基因的預測及RLM-5′RACE驗證以高山松miR171成熟序列為對象、高山松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為靶標,用psRNAtarget進行pde-miR171a靶基因預測。如表2所示,pde-miR171a的靶基因分別為GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)、肌動蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401) 及未知蛋白 (Unigene84522), 其中pde-miR171a與高山松GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子Unigene10015)的匹配程度最高。

    為了進一步驗證高山松miR171a對潛在靶基因是否存在剪切作用,筆者用RLM-5′RACE方法對靶基因Unigene10015、Unigene83401 mRNA的3′ 端剪切產(chǎn)物進行擴增。測序結(jié)果表明,高山松 pde-miR171a對GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子的剪切位點位于第13個至第14個堿基之間,對肌動蛋白結(jié)合蛋白的剪切位點位于經(jīng)典切割位點下游第20個堿基處(圖5),表明GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)和肌動蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401)的基因確實是miR171a的靶基因,miR171a可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子和肌動蛋白結(jié)合蛋白基因的表達。

    2.4 高山松pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在不同組織中的表達分析

    通過熒光定量PCR檢測pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在高山松根、 莖和針葉中的表達情況。結(jié)果(圖6)顯示,pde-miR171a、Unigene10015在高山松不同組織中的表達情況存在差異,pde-miR171a在莖中的相對表達量最高,其次在針葉中,而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達量最低;靶基因Unigene10015的相對表達量與pde-miR171a的相對表達量呈負相關。

    3 討論與結(jié)論

    隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展,對裸子植物進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序的研究不斷增多,有助于通過生物信息學方法對miRNAs的鑒定提供數(shù)據(jù)基礎[14-16]。本研究對鑒定到的 miR171a前體基因Pre-miR171a進行克隆, 得到miR71a的前體序列長度為96 bp,可形成穩(wěn)定的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),說明miR171a確實在高山松中存在并表達。最小折疊自由能指數(shù)(minimal folding free energy index,簡稱MFEI)是將miRNA與其他小分子RNA區(qū)分開來的重要參數(shù),一般植物的MFEI大于0.85[17]。在本研究中, miR71a前體的MFEI為1.28, 顯著高于黑胡椒miR171前體的MFEI(0.80)[6],但與擬南芥[18]、水稻[8]和煙草[10]中miRNA前體的MFEI類似。這些結(jié)果為進一步研究高山松miR171a的功能奠定了基礎。

    植物的成熟miRNA能通過核酸互補指導RNA誘導的沉默復合體(RISC)去切割或者抑制靶基因表達[19]。目前主要采用5′RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法驗證miRNA對靶基因mRNA的切割作用[12]。筆者用RLM-5′RACE方法對預測的2個靶基因Unigene10015(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)、Unigene83401(肌動蛋白結(jié)合蛋白)進行驗證。結(jié)果顯示,高山松miR171a介導靶基因Unigene10015(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)的mRNA剪切降解,且剪切位點在第13、第14位堿基之間。通過5′RACE試驗方法發(fā)現(xiàn),擬南芥中GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子Scarecrow-Like是miR171的靶基因,切割位點也在第13、第14位堿基之間[7]。另外,高山松miR171a與靶基因Unigene83401(肌動蛋白結(jié)合蛋白)的切割位點在典型的miRNA切割位點下游第20個堿基處,這可能是由于siRNA在miRNA切割位點下游第20個核苷酸處發(fā)生的第2次切割[20]。以上結(jié)果表明,miR71a能夠通過識別、結(jié)合,然后切割相應的靶基因,從而調(diào)控高山松的生長發(fā)育。

    參考文獻:

    [1]Bartel D P. MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J]. Cell,2004,116(2):281-297.

    [2]Zhang B H,Pan X P,Cobb G P,et al. Plant microRNA:a small regulatory molecule with big impact[J]. Developmental Biology,2006,289(1):3-16.

    [3]Wan L C,Zhang H Y,Lu S F,et al. Transcriptome-wide identification and characterization of miRNAs from Pinus densata[J]. BMC Genomics,2012,13:132-142.

    [4]Cao D C,Xu H M,Zhao Y Y,et al. Transcriptome and degradome sequencing reveals dormancy mechanisms of Cunninghamia lanceolata seeds[J]. Plant Physiology,2016,172(4):2347-2362.

    [5]Li W F,Zhang S G,Han S Y,et al. The post-transcriptional regulation of LaSCL6,by miR171 during maintenance of embryogenic potential in Larix kaempferi(Lamb.)Carr.[J]. Tree Genetics & Genomes,2014,10(1):223-229.

    [6]Asha S,Nisha J,Soniya E V. In silico characterisation and phylogenetic analysis of two evolutionarily conserved miRNAs (miR166 and miR171) from black pepper (Piper nigrum L.)[J]. Plant Molecular Biology Reporter,2013,31:707-718.

    [7]Llave C,Xie Z X,Kasschau K D,et al. Cleavage of scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA[J]. Science,2002,297(5589):2053-2056.

    [8]Fan T,Li X M,Yang W,et al. Rice osa-miR171c mediates phase change from vegetative to reproductive development and shoot apical meristem maintenance by repressing four OsHAM transcription factors[J]. PLoS One,2015,10(5):e0125833.

    [9]劉志祥,曾超珍,曾渭賢,等. 楊樹MIR171基因家族進化與功能分化研究[J]. 植物遺傳資源學報,2014,15(2):313-319.

    [10]張 力,沙愛華. 煙草microRNA171c的功能分析[J]. 植物科學學報,2016,34(5):775-780.

    [11]Wang B S,Mao J F,Gao J,et al. Colonization of the Tibetan plateau by the homoploid hybrid pine Pinus densata[J]. Molecular Ecology,2011,20(18):3796-3811.

    [12]孔 雷,朱向向,王屹瑋,等. 茶樹miR164a及其靶基因的鑒定與表達分析[J]. 茶葉科學,2018,38(6):547-558.

    [13]Livak K J,Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

    [14]Qiu Z B,Wan L C,Chen T,et al. The regulation of cambial activity in Chinese fir (Cunninghamia lanceolata) involves extensive transcriptome remodelling[J]. New Phytologist,2013,199(3):708-719.

    [15]Wang L,Zhao J,Luo K,et al. Deep sequencing discovery and profiling of conserved and novel miRNAs in the ovule of Ginkgo biloba[J]. Trees,2016,30(5):1557-1567.

    [16]Wen C H,Lin S S,Chu F H. Transcriptome analysis of a subtropical deciduous tree:autumn leaf senescence gene expression profile of Formosan gum[J]. Plant & Cell Physiology,2015,56(1):163-174.

    [17]Zhang B H,Pan X P,Cox S B,et al. Evidence that miRNAs are different from other RNAs[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2006,63(2):246-254.

    [18]Wang L,Mai Y X,Zhang Y C,et al. 2010. MicroRNA171c-targeted SCL6-Ⅱ,SCL6-Ⅲ and SCL6-Ⅳ genes regulate shoot branching in Arabidopsis[J]. Molecular Plant,3(5):794-806.

    [19]Carthew R W,Sontheimer E J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J]. Cell,2009,136(4):642-655.

    [20]Ronemus M,Vaughn M W,Martienssen R A. MicroRNA-targeted and small interfering RNA-mediated mRNA degradation is regulated by argonaute,dicer,and RNA-dependent RNA polymerase in Arabidopsis[J]. Plant Cell,2006,18(7):1559-1574.

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