• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高山松miR171a及其靶基因的鑒定與表達分析

    2021-05-26 16:53:34張雪如王穩(wěn)利邱宗波曾倩倩
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2021年7期
    關鍵詞:熒光定量PCR

    張雪如 王穩(wěn)利 邱宗波 曾倩倩

    摘要:以裸子植物高山松為試驗材料,利用筆者所在實驗室前期構(gòu)建的高山松miRNA數(shù)據(jù),通過生物信息學方法篩選與高山松生長發(fā)育相關的miR171a,并通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增法(RLM-5′RACE)驗證得出,GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)和肌動蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401)的基因為高山松miR171a的靶基因。通過PCR技術(shù)克隆得到的高山松miR171a前體序列可形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),但其成熟序列的堿基保守性較差。系統(tǒng)進化分析顯示,pde-miR171a與裸子植物火炬松的進化關系較近。經(jīng)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),pde-miR171a在高山松莖中的相對表達量最高,其次是在針葉中,而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達量較低,暗示pde-miR171a可以通過調(diào)控靶基因Unigene10015而參與高山松的生長發(fā)育。

    關鍵詞:高山松;miR171;靶基因;熒光定量PCR

    中圖分類號: S718.46文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2021)07-0062-05

    收稿日期:2020-08-05

    基金項目:國家自然科學基金(編號:31500499);河南省高??萍紕?chuàng)新人才項目(編號:16HASTIT019)。

    作者簡介:張雪如(1996—),女,河南洛陽人,碩士研究生,主要從事植物發(fā)育生物學方面的研究。E-mail:1365655297@qq.com。

    通信作者:邱宗波,博士,教授,主要從事植物分子生物學方面的研究。E-mail:qiuzongbo@126.com。

    microRNA(miRNA)是一類由21~24個核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈小RNA,主要是在轉(zhuǎn)錄后水平介導靶mRNA的降解或翻譯抑制來調(diào)控基因表達[1]。自研究者從秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)第1個 miRNA以來,miRNA一直是研究的熱點[2]。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),miRNAs在高山松(Pinus densata)的生長發(fā)育[3]、杉木種子的萌發(fā)[4]及落葉松體胚的生長發(fā)育和形態(tài)建成等方面起著重要的調(diào)控作用[5]。

    miR171是在植物中最早發(fā)現(xiàn)的miRNAs家族成員之一[6],在擬南芥中有3個miRNA成員,分別是ath-miR171a、ath-miR171b和ath-miR171c[7]。通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增(RNA ligase-mediated 5′ rapid amplification of cDNA ends,簡稱RLM-5′RACE)試驗,研究者發(fā)現(xiàn)水稻中的miR171能介導靶基因OsHAM(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)mRNA的剪切降解,從而促進水稻營養(yǎng)生長向生殖生長的過渡及根尖分生組織穩(wěn)態(tài)的形成[8]。楊樹miR171通過調(diào)控GRAS轉(zhuǎn)錄因子而參與楊樹的生長發(fā)育和光形態(tài)建成的調(diào)控[9]。張力等研究發(fā)現(xiàn),煙草miR171c通過負調(diào)控SCL靶基因TC134811、TC127385,使植物出現(xiàn)頂端優(yōu)勢喪失和莖稈增多等表型[10]。盡管目前關于miR171在多個植物中功能的研究較多,但目前在裸子植物高山松中,miR171的鑒定及其在高山松生長發(fā)育過程中的功能尚不清楚。

    高山松是一種具有重要生態(tài)意義的裸子植物[11]。本研究根據(jù)高山松小RNA高通量測序結(jié)果獲得的miR171a,進行前體序列的克隆與分析。通過在線預測網(wǎng)站獲得 miR171a的靶基因,并通過RLM-5′RACE進行驗證。同時還分析了miR171a及其靶基因在高山松不同組織部位的表達特性,為揭示miR171a在高山松生長發(fā)育中的作用提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    2月齡的高山松幼苗于2019年5月置于溫室中培養(yǎng)(晝—夜生長溫度周期為 25 ℃—18 ℃,光—暗周期為16 h—8 h,相對濕度為65%~70%)。

    1.2 高山松miR171前體序列的克隆及其二級結(jié)構(gòu)預測

    使用植物Concert Plant RNA Reagent (美國Invitrogen公司)從2月齡的高山松幼苗中提取總RNA。從筆者所在實驗室得到的高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中獲得高山松miR171a的前體序列:5′-AAAGAAUGUGAUGUUGGCUAGGCUCAAUCGGAUUGUAACGCCCACGGAAUUUGGUCUUGUGAUCUGAUUGAGCCGUGCCAAUAUCACAUUCUAAC-3′,用Primer 5.0軟件設計特異性引物進行PCR 擴增(表1)。采用Clustalx 2.0軟件,以高梁sbi-miR171a、擬南芥ath-miR171a、油菜bna-miR171a、玉米 zma-miR171a、大豆gma-miR171a、火炬松pta-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、水稻osa-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a的成熟序列為模板進行序列比對。用MEGA 7.0構(gòu)建miR171a前體序列的系統(tǒng)進化樹,通過RNAfold web server在線軟件預測miR171a前體序列的二級結(jié)構(gòu)。

    1.3 高山松miR171a靶基因的預測與切割位點的驗證

    將高山松miR171a的成熟序列提交到靶基因在線預測網(wǎng)站psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)上,以高山松的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫作為靶標,設置期望值為2.5,其余參數(shù)為默認值。將預測到的靶基因比對到GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫中,確定其功能。依據(jù)靶基因的cDNA序列,用Primer 5.0軟件設計用于RLM-5′RACE的引物(表1)。RLM-5′RACE試驗參照孔雷等的方法[12],擴增出的特異產(chǎn)物后進行克隆測序。

    1.4 實時熒光定量PCR

    使用植物Concert Plant RNA Reagent (美國Invitrogen公司)分別提取2月齡高山松幼苗根、莖和針葉的總RNA。用Superscript Ⅱ reverse transcriptase (美國Invitrogen公司)進行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量試驗使用Thunderbird SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本Toyobo公司)。以actin作為miR171a和靶基因Unigene10015的內(nèi)參基因。利用Rotor-Gene 3000型實時PCR擴增儀檢測,每個樣品設3次生物學重復?;蛳鄬Ρ磉_量的測定采用2-ΔΔCT法(C表示循環(huán)數(shù);T表示熒光閾值)[13],將基因在根中的表達水平設成1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pde-miR171a前體序列的擴增及二級結(jié)構(gòu)的預測

    從筆者所在實驗室前期得到的高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中篩選得到高山松miR171a的前體序列,進行引物設計,以高山松基因組DNA為模板進行PCR擴增,得到高山松miR171a的前體序列長度為96 bp(圖1)。用RNAfolder軟件在線分析其二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)高山松pre-miR171a可折疊成典型的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖 2),預測得出其二級結(jié)構(gòu)的最小折疊自由能(minimal folding free energy,簡稱MFE)為-230.74 kJ/mol,最小折疊自由能指數(shù)(minimal folding free energy index,MFEI)為1.28,miR171a的成熟序列(5′-UGAUUGAGCCGUGCCA AUAUC-3′)位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3′端。

    2.2 高山松miR171a成熟序列和前體序列的分析

    對miRBase數(shù)據(jù)庫中不同植物的miR171a成熟序列與高山松miR171a(pde-miR171a)的成熟序列進行比對,發(fā)現(xiàn)除了高梁sbi-miR171a、pde-miR171a的成熟序列完全一致外,其他物種的miR171a如擬南芥ath-miR171a、玉米zma-miR171a、火炬松pta-miR171a、水稻osa-miR171a、油菜bna-miR171a、大豆gma-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a與高山松pde-miR171a的成熟序列間有1個或多個堿基的差異(圖3),表明高山松 pde-miR171a的成熟序列在不同物種中的保守性不高。用MEGA 7.0對毛白楊、玉米、卷柏、高梁、擬南芥、火炬松、大豆、水稻、油菜和高山松的MIR171a共25個成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖4)顯示,不同物種的MIR171前體保守性不高,高山松與火炬松的前體序列聚為一類,二者間的進化關系較近。

    2.3 高山松miR171a靶基因的預測及RLM-5′RACE驗證以高山松miR171成熟序列為對象、高山松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為靶標,用psRNAtarget進行pde-miR171a靶基因預測。如表2所示,pde-miR171a的靶基因分別為GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)、肌動蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401) 及未知蛋白 (Unigene84522), 其中pde-miR171a與高山松GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子Unigene10015)的匹配程度最高。

    為了進一步驗證高山松miR171a對潛在靶基因是否存在剪切作用,筆者用RLM-5′RACE方法對靶基因Unigene10015、Unigene83401 mRNA的3′ 端剪切產(chǎn)物進行擴增。測序結(jié)果表明,高山松 pde-miR171a對GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子的剪切位點位于第13個至第14個堿基之間,對肌動蛋白結(jié)合蛋白的剪切位點位于經(jīng)典切割位點下游第20個堿基處(圖5),表明GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)和肌動蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401)的基因確實是miR171a的靶基因,miR171a可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子和肌動蛋白結(jié)合蛋白基因的表達。

    2.4 高山松pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在不同組織中的表達分析

    通過熒光定量PCR檢測pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在高山松根、 莖和針葉中的表達情況。結(jié)果(圖6)顯示,pde-miR171a、Unigene10015在高山松不同組織中的表達情況存在差異,pde-miR171a在莖中的相對表達量最高,其次在針葉中,而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達量最低;靶基因Unigene10015的相對表達量與pde-miR171a的相對表達量呈負相關。

    3 討論與結(jié)論

    隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展,對裸子植物進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序的研究不斷增多,有助于通過生物信息學方法對miRNAs的鑒定提供數(shù)據(jù)基礎[14-16]。本研究對鑒定到的 miR171a前體基因Pre-miR171a進行克隆, 得到miR71a的前體序列長度為96 bp,可形成穩(wěn)定的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),說明miR171a確實在高山松中存在并表達。最小折疊自由能指數(shù)(minimal folding free energy index,簡稱MFEI)是將miRNA與其他小分子RNA區(qū)分開來的重要參數(shù),一般植物的MFEI大于0.85[17]。在本研究中, miR71a前體的MFEI為1.28, 顯著高于黑胡椒miR171前體的MFEI(0.80)[6],但與擬南芥[18]、水稻[8]和煙草[10]中miRNA前體的MFEI類似。這些結(jié)果為進一步研究高山松miR171a的功能奠定了基礎。

    植物的成熟miRNA能通過核酸互補指導RNA誘導的沉默復合體(RISC)去切割或者抑制靶基因表達[19]。目前主要采用5′RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法驗證miRNA對靶基因mRNA的切割作用[12]。筆者用RLM-5′RACE方法對預測的2個靶基因Unigene10015(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)、Unigene83401(肌動蛋白結(jié)合蛋白)進行驗證。結(jié)果顯示,高山松miR171a介導靶基因Unigene10015(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)的mRNA剪切降解,且剪切位點在第13、第14位堿基之間。通過5′RACE試驗方法發(fā)現(xiàn),擬南芥中GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子Scarecrow-Like是miR171的靶基因,切割位點也在第13、第14位堿基之間[7]。另外,高山松miR171a與靶基因Unigene83401(肌動蛋白結(jié)合蛋白)的切割位點在典型的miRNA切割位點下游第20個堿基處,這可能是由于siRNA在miRNA切割位點下游第20個核苷酸處發(fā)生的第2次切割[20]。以上結(jié)果表明,miR71a能夠通過識別、結(jié)合,然后切割相應的靶基因,從而調(diào)控高山松的生長發(fā)育。

    參考文獻:

    [1]Bartel D P. MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J]. Cell,2004,116(2):281-297.

    [2]Zhang B H,Pan X P,Cobb G P,et al. Plant microRNA:a small regulatory molecule with big impact[J]. Developmental Biology,2006,289(1):3-16.

    [3]Wan L C,Zhang H Y,Lu S F,et al. Transcriptome-wide identification and characterization of miRNAs from Pinus densata[J]. BMC Genomics,2012,13:132-142.

    [4]Cao D C,Xu H M,Zhao Y Y,et al. Transcriptome and degradome sequencing reveals dormancy mechanisms of Cunninghamia lanceolata seeds[J]. Plant Physiology,2016,172(4):2347-2362.

    [5]Li W F,Zhang S G,Han S Y,et al. The post-transcriptional regulation of LaSCL6,by miR171 during maintenance of embryogenic potential in Larix kaempferi(Lamb.)Carr.[J]. Tree Genetics & Genomes,2014,10(1):223-229.

    [6]Asha S,Nisha J,Soniya E V. In silico characterisation and phylogenetic analysis of two evolutionarily conserved miRNAs (miR166 and miR171) from black pepper (Piper nigrum L.)[J]. Plant Molecular Biology Reporter,2013,31:707-718.

    [7]Llave C,Xie Z X,Kasschau K D,et al. Cleavage of scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA[J]. Science,2002,297(5589):2053-2056.

    [8]Fan T,Li X M,Yang W,et al. Rice osa-miR171c mediates phase change from vegetative to reproductive development and shoot apical meristem maintenance by repressing four OsHAM transcription factors[J]. PLoS One,2015,10(5):e0125833.

    [9]劉志祥,曾超珍,曾渭賢,等. 楊樹MIR171基因家族進化與功能分化研究[J]. 植物遺傳資源學報,2014,15(2):313-319.

    [10]張 力,沙愛華. 煙草microRNA171c的功能分析[J]. 植物科學學報,2016,34(5):775-780.

    [11]Wang B S,Mao J F,Gao J,et al. Colonization of the Tibetan plateau by the homoploid hybrid pine Pinus densata[J]. Molecular Ecology,2011,20(18):3796-3811.

    [12]孔 雷,朱向向,王屹瑋,等. 茶樹miR164a及其靶基因的鑒定與表達分析[J]. 茶葉科學,2018,38(6):547-558.

    [13]Livak K J,Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

    [14]Qiu Z B,Wan L C,Chen T,et al. The regulation of cambial activity in Chinese fir (Cunninghamia lanceolata) involves extensive transcriptome remodelling[J]. New Phytologist,2013,199(3):708-719.

    [15]Wang L,Zhao J,Luo K,et al. Deep sequencing discovery and profiling of conserved and novel miRNAs in the ovule of Ginkgo biloba[J]. Trees,2016,30(5):1557-1567.

    [16]Wen C H,Lin S S,Chu F H. Transcriptome analysis of a subtropical deciduous tree:autumn leaf senescence gene expression profile of Formosan gum[J]. Plant & Cell Physiology,2015,56(1):163-174.

    [17]Zhang B H,Pan X P,Cox S B,et al. Evidence that miRNAs are different from other RNAs[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2006,63(2):246-254.

    [18]Wang L,Mai Y X,Zhang Y C,et al. 2010. MicroRNA171c-targeted SCL6-Ⅱ,SCL6-Ⅲ and SCL6-Ⅳ genes regulate shoot branching in Arabidopsis[J]. Molecular Plant,3(5):794-806.

    [19]Carthew R W,Sontheimer E J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J]. Cell,2009,136(4):642-655.

    [20]Ronemus M,Vaughn M W,Martienssen R A. MicroRNA-targeted and small interfering RNA-mediated mRNA degradation is regulated by argonaute,dicer,and RNA-dependent RNA polymerase in Arabidopsis[J]. Plant Cell,2006,18(7):1559-1574.

    猜你喜歡
    熒光定量PCR
    長期夜班工作醫(yī)護人員腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化
    基于線粒體DNA COⅠ基因鑒別畜禽肉中雞源性成分
    肉類研究(2017年8期)2017-11-16 12:06:16
    兒童肺炎支原體感染三種實驗診斷方法評價
    獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌的熒光定量PCR檢測方法優(yōu)化
    泌尿生殖道淋球菌、解脲支原體、沙眼衣原體感染特點分析
    肉制品中沙門氏菌熒光定量PCR標準質(zhì)粒的構(gòu)建
    國產(chǎn)PCR試劑和COBAS系統(tǒng)血清HBV—DNA檢測結(jié)果不一致的原因分析
    弗氏檸檬酸桿菌SYBRGreenⅠ熒光定量PCR診斷方法的建立及耐藥性分析
    實時熒光定量PCR在手足口病原體檢測中的應用探討
    今日健康(2016年12期)2016-11-17 19:21:34
    兔出血癥病毒感染機體后炎性因子的檢測分析
    亚洲av福利一区| 亚洲伊人久久精品综合| 午夜免费观看性视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 青青草视频在线视频观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 最新中文字幕久久久久| 国产av一区二区精品久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费大片18禁| 日韩伦理黄色片| 90打野战视频偷拍视频| 伊人久久国产一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲av电影在线进入| 夜夜爽夜夜爽视频| 韩国av在线不卡| xxxhd国产人妻xxx| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 少妇高潮的动态图| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品国产乱码久久久久久小说| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 18+在线观看网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 女性被躁到高潮视频| 97在线视频观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩成人伦理影院| 亚洲国产成人一精品久久久| 婷婷色综合www| 91久久精品国产一区二区三区| 99香蕉大伊视频| 永久免费av网站大全| 99国产综合亚洲精品| 岛国毛片在线播放| 少妇精品久久久久久久| 一二三四在线观看免费中文在 | 国产在视频线精品| 伦理电影免费视频| 亚洲美女视频黄频| 久久免费观看电影| 青春草亚洲视频在线观看| 中文欧美无线码| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产探花极品一区二区| 婷婷色av中文字幕| 国精品久久久久久国模美| 亚洲精品乱久久久久久| 日本与韩国留学比较| 90打野战视频偷拍视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | av片东京热男人的天堂| 男的添女的下面高潮视频| 十八禁网站网址无遮挡| 日韩视频在线欧美| 久久久久久人妻| 狂野欧美激情性bbbbbb| 精品少妇内射三级| 男女国产视频网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 男女下面插进去视频免费观看 | 久久午夜综合久久蜜桃| 美女主播在线视频| 国产成人精品无人区| 看十八女毛片水多多多| 蜜桃在线观看..| 精品人妻一区二区三区麻豆| a 毛片基地| 我的女老师完整版在线观看| 观看av在线不卡| 香蕉丝袜av| 久热这里只有精品99| 欧美成人午夜免费资源| 少妇 在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件 | 国产在线一区二区三区精| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品少妇内射三级| 久久ye,这里只有精品| 精品午夜福利在线看| 久久99精品国语久久久| 色网站视频免费| 久久久欧美国产精品| 亚洲少妇的诱惑av| 超碰97精品在线观看| 曰老女人黄片| videossex国产| 日韩成人av中文字幕在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 国产av国产精品国产| 亚洲av福利一区| 亚洲av成人精品一二三区| 只有这里有精品99| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲欧美清纯卡通| 久久影院123| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲av成人精品一二三区| a级毛片在线看网站| 久久精品人人爽人人爽视色| 午夜免费观看性视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 中文字幕免费在线视频6| 激情视频va一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 亚洲综合精品二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 制服人妻中文乱码| 一级毛片电影观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 各种免费的搞黄视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 18在线观看网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产伦理片在线播放av一区| h视频一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美成人午夜免费资源| 丰满饥渴人妻一区二区三| 丰满少妇做爰视频| 人人澡人人妻人| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品人妻久久久影院| 国产免费视频播放在线视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一级片免费观看大全| 大陆偷拍与自拍| 黄色一级大片看看| 亚洲久久久国产精品| 18+在线观看网站| 国产成人精品一,二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 中文字幕亚洲精品专区| 人妻少妇偷人精品九色| 国产亚洲精品久久久com| 性色avwww在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 9191精品国产免费久久| 美女福利国产在线| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久这里有精品视频免费| 久久精品国产a三级三级三级| 涩涩av久久男人的天堂| 晚上一个人看的免费电影| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久久久网色| 日本欧美国产在线视频| 久久国内精品自在自线图片| 性色avwww在线观看| 精品国产国语对白av| av卡一久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久热在线av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 成人手机av| 亚洲精品自拍成人| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜福利网站1000一区二区三区| 满18在线观看网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 国产精品一区二区在线观看99| 久久国产精品大桥未久av| 大陆偷拍与自拍| 免费观看在线日韩| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产精品久久久久久久久免| 飞空精品影院首页| 免费黄网站久久成人精品| 成年av动漫网址| 国产乱人偷精品视频| 日日啪夜夜爽| 国产乱人偷精品视频| 高清在线视频一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 夜夜爽夜夜爽视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品亚洲成国产av| 乱码一卡2卡4卡精品| 丁香六月天网| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲性久久影院| 伦精品一区二区三区| 久久av网站| 国产欧美亚洲国产| 久久久国产精品麻豆| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 2022亚洲国产成人精品| freevideosex欧美| 街头女战士在线观看网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲av.av天堂| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产视频首页在线观看| 欧美性感艳星| 免费大片18禁| 国产综合精华液| 丝袜美足系列| 日本欧美国产在线视频| 亚洲人与动物交配视频| 国产 精品1| 亚洲精品第二区| 国产av国产精品国产| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品欧美亚洲77777| 搡老乐熟女国产| 免费观看性生交大片5| 咕卡用的链子| 少妇 在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 尾随美女入室| 欧美日韩综合久久久久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲国产欧美在线一区| 男女高潮啪啪啪动态图| 最近中文字幕高清免费大全6| 最近手机中文字幕大全| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲伊人色综图| tube8黄色片| 18+在线观看网站| www.av在线官网国产| 在线看a的网站| 国产精品一国产av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美另类一区| 国产精品久久久久久av不卡| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品蜜桃在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 18+在线观看网站| www.av在线官网国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | a级毛片黄视频| 婷婷色av中文字幕| 乱人伦中国视频| 成年动漫av网址| 国产精品.久久久| 一级片免费观看大全| 亚洲美女视频黄频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产熟女午夜一区二区三区| 视频区图区小说| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产男女内射视频| 大码成人一级视频| 在线观看三级黄色| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产高清国产精品国产三级| av电影中文网址| 妹子高潮喷水视频| 日韩视频在线欧美| 十八禁网站网址无遮挡| 日本免费在线观看一区| 中文欧美无线码| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久青草综合色| 99久国产av精品国产电影| 亚洲av综合色区一区| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 在线免费观看不下载黄p国产| 中文字幕免费在线视频6| 午夜福利视频在线观看免费| 国产在线视频一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 少妇人妻久久综合中文| 视频中文字幕在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 晚上一个人看的免费电影| 欧美精品高潮呻吟av久久| 十八禁网站网址无遮挡| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美性感艳星| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久99精品国语久久久| 五月玫瑰六月丁香| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成人二区视频| 赤兔流量卡办理| 国产高清不卡午夜福利| 街头女战士在线观看网站| 精品久久国产蜜桃| 春色校园在线视频观看| 国产精品蜜桃在线观看| 美女中出高潮动态图| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 美女视频免费永久观看网站| 日韩一区二区视频免费看| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品,欧美精品| 日韩av免费高清视频| 精品久久久精品久久久| 久久精品国产亚洲av天美| 十八禁网站网址无遮挡| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品色激情综合| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品久久久久久精品古装| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产有黄有色有爽视频| 草草在线视频免费看| 99久久精品国产国产毛片| 26uuu在线亚洲综合色| 视频中文字幕在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产av一区二区精品久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 十八禁高潮呻吟视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美性感艳星| 18禁观看日本| 看免费成人av毛片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品午夜福利在线看| 高清不卡的av网站| 水蜜桃什么品种好| 午夜影院在线不卡| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产麻豆69| 观看美女的网站| a级毛色黄片| 亚洲精品一二三| 久久久亚洲精品成人影院| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 两个人看的免费小视频| 欧美成人午夜精品| 另类亚洲欧美激情| 午夜福利网站1000一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产色爽女视频免费观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产极品天堂在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产 一区精品| 国产精品欧美亚洲77777| 黑人猛操日本美女一级片| 老司机亚洲免费影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av国产av综合av卡| 国产激情久久老熟女| 99久国产av精品国产电影| 精品亚洲成a人片在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲av男天堂| 午夜福利影视在线免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲经典国产精华液单| 久久久久精品久久久久真实原创| 在线观看免费高清a一片| 香蕉精品网在线| 日本黄色日本黄色录像| 免费在线观看黄色视频的| 嫩草影院入口| 乱人伦中国视频| 伦理电影大哥的女人| 久久这里只有精品19| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲经典国产精华液单| 精品国产一区二区久久| 大片免费播放器 马上看| 另类精品久久| 亚洲精品美女久久av网站| 精品久久久久久电影网| 性色avwww在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| xxx大片免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成年动漫av网址| 蜜臀久久99精品久久宅男| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲精品456在线播放app| 大香蕉久久网| 桃花免费在线播放| 免费日韩欧美在线观看| h视频一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久久久久国产电影| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 极品人妻少妇av视频| 中国国产av一级| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产亚洲精品久久久com| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品熟女久久久久浪| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲av国产av综合av卡| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费av不卡在线播放| 亚洲综合色网址| a级毛色黄片| 在线天堂中文资源库| 99热网站在线观看| 9热在线视频观看99| 国产毛片在线视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 春色校园在线视频观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 91国产中文字幕| 美女内射精品一级片tv| 免费人成在线观看视频色| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产色婷婷99| 2022亚洲国产成人精品| 国产综合精华液| 伊人久久国产一区二区| 国产成人精品在线电影| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩一区二区三区影片| 免费大片黄手机在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久人人爽人人片av| 黄色配什么色好看| 黑人高潮一二区| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人精品在线电影| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费看av在线观看网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 女人精品久久久久毛片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 黄色一级大片看看| 精品久久国产蜜桃| 国产精品一二三区在线看| 90打野战视频偷拍视频| 少妇的逼好多水| 黄色 视频免费看| 日本-黄色视频高清免费观看| 成人漫画全彩无遮挡| av黄色大香蕉| 国产黄色免费在线视频| 国产精品久久久久久av不卡| 成年女人在线观看亚洲视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 高清欧美精品videossex| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲综合色惰| 99热全是精品| 大陆偷拍与自拍| 在线观看国产h片| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av国产av综合av卡| 大片免费播放器 马上看| 亚洲人成网站在线观看播放| 一区二区av电影网| 51国产日韩欧美| 夫妻性生交免费视频一级片| 精品一区在线观看国产| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 午夜日本视频在线| 久久精品国产综合久久久 | 美女国产视频在线观看| 人妻系列 视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美性感艳星| 国产精品久久久av美女十八| 街头女战士在线观看网站| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲美女搞黄在线观看| freevideosex欧美| 亚洲欧美清纯卡通| 国产在线视频一区二区| 国产激情久久老熟女| 国产深夜福利视频在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 99久久精品国产国产毛片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久久久人妻| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 日本免费在线观看一区| 亚洲精品久久午夜乱码| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一级毛片 在线播放| 香蕉精品网在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一区二区三区乱码不卡18| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国国产精品蜜臀av免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本色播在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 国产有黄有色有爽视频| 久久97久久精品| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜激情久久久久久久| 日日啪夜夜爽| 日韩伦理黄色片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产成人精品无人区| av国产久精品久网站免费入址| 欧美激情国产日韩精品一区| 夫妻午夜视频| 少妇精品久久久久久久| 精品国产一区二区久久| 国产精品久久久久久精品古装| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久国产精品麻豆| 日韩成人av中文字幕在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 久久精品国产综合久久久 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 九九爱精品视频在线观看| 街头女战士在线观看网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人精品无人区| 亚洲精品国产av成人精品| videosex国产| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| www.熟女人妻精品国产 | 日本vs欧美在线观看视频| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品,欧美精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 边亲边吃奶的免费视频| av不卡在线播放| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲成人手机| 伦理电影大哥的女人| 最近中文字幕高清免费大全6| a级片在线免费高清观看视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 午夜影院在线不卡| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产免费又黄又爽又色| 久久影院123| 亚洲国产精品999| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲人成77777在线视频| www日本在线高清视频| 视频在线观看一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久久久国产电影| 日韩大片免费观看网站| 久久婷婷青草| 两个人看的免费小视频| 日韩成人伦理影院| 天堂8中文在线网| 国产毛片在线视频| 午夜老司机福利剧场| av网站免费在线观看视频| 国产亚洲一区二区精品| 一区二区av电影网| 精品亚洲成国产av| 黑人高潮一二区| 午夜福利乱码中文字幕| 国产高清国产精品国产三级| 久久久久国产网址| 2021少妇久久久久久久久久久| 2022亚洲国产成人精品| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲欧洲国产日韩| 丁香六月天网| 久久久国产一区二区| 国产又色又爽无遮挡免| 视频中文字幕在线观看| 五月开心婷婷网| 亚洲综合精品二区| 国产免费一级a男人的天堂| 少妇人妻精品综合一区二区| 两性夫妻黄色片 | 久久久久国产网址| 精品卡一卡二卡四卡免费| 免费观看av网站的网址| 成人黄色视频免费在线看| 久久久久久人人人人人| 亚洲综合色惰|