miR-211對高糖誘導(dǎo)下晶狀體上皮細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控作用*

孟娜, 顧悅, 孔瑞芹, 王瑛璞

1河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科(河南洛陽 471000)； 2西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院眼科 (陜西西安 710038)

糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract, DC)是糖尿病患者致盲的一個重要因素。糖尿病患者血糖濃度始終處于異常高水平狀態(tài)，長期的高糖環(huán)境引起晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)的氧化應(yīng)激損傷是高糖環(huán)境下晶狀體渾濁的主要原因之一，細胞內(nèi)過量的ROS及晶狀體內(nèi)抗氧化物酶失活，導(dǎo)致晶狀體細胞抗氧化能力下降。是引起糖尿病患者視力低下的主要原因[1-2]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單RNA分子，可通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯進而參與白內(nèi)障發(fā)生及發(fā)展過程[3]。近年來發(fā)現(xiàn)多種miRNA在LECs的氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮作用，參與白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。miR-211是miRNA家族成員，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-211在白內(nèi)障患者晶狀體組織中呈高表達，且能促進LECs的凋亡[6]。2019年2—6月，本研究探討miR-211對高糖誘導(dǎo)的LECs氧化應(yīng)激的影響及其可能的作用機制，為白內(nèi)障的防治尋找潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 永生型人LECs HLEC-B3細胞株(中國科學(xué)院上海細胞庫)；含雙抗的1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(杭州四季青公司)；miR-211抑制劑(miR-211 inhibitor)和miR-211陰性對照(miR-211 NC)(上海吉瑪基因公司)；LipofectamineTM2000(美國Sigma公司)；Trizol(杭州四季青公司)；SIRT1、FoxO3a一抗(美國Invitrogen公司)；山羊抗兔IgG(H+L)二抗(美國Sigma公司)總抗氧化能力(total-antioxidative capability, T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutas, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、還原型谷胱甘肽(glutathone, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測試劑盒(上海碧云天有限公司)。

酶標(biāo)儀(美國 Biorad 公司)，實時定量PCR儀(美國ABI 7500)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將HLEC-B3細胞株解凍、復(fù)蘇，用含10%FBS和1%雙抗的1640培養(yǎng)基重懸細胞，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d用胰蛋白酶消化傳代1次。取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 高糖誘導(dǎo)HLEC-B3細胞氧化應(yīng)激模型的制備 取對數(shù)期細胞，待細胞融合近80%時，用含1%FBS的1640培養(yǎng)基，與不同濃度的葡萄糖供培養(yǎng)，按照葡萄糖濃度的不同分為4組：0 mmol/L組、10 mmol/L組、20 mmol/L組、40 mmol/L組，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期HLEB-3細胞，用含1%FBS的1640培養(yǎng)基重懸，將細胞接種于6孔板，調(diào)整細胞密度為2×105個/孔，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書中所示步驟，將miR-211 inhibitor和miR-211 NC分別轉(zhuǎn)染至HLEB-3細胞，轉(zhuǎn)染6 h后，將各組細胞轉(zhuǎn)移至含40 mmol/L的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 RT-PCR RT-PCR檢測各氧化應(yīng)激模型組細胞內(nèi)miR-211表達。將HLEC-B3細胞于不同濃度葡萄糖共培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，RT-PCR檢測相關(guān)基因的表達水平，Takara SYBR Green熒光定量試劑盒設(shè)定反應(yīng)體系：Master Mix 10 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 10 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性25 s，60℃退火40 s，60℃延伸50 s，重復(fù)45個循環(huán)。β-actin為管家基因，2-ΔΔCt為目的基因的相對表達量。每個反應(yīng)重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值。內(nèi)參β-actin引物序列：F:5′-TAGGCTTAGGCTAGGCTTAC-3′，R:5′-CTAGGCTTAGCTAGGCCACT-3′，miR-211引物序列：F:5′-CGTTGACGGTAGCTAACAGT-3′，R: 5′-TAGGTTCGATGGCTACGCAT-3′。每個實驗結(jié)果獨立重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot Western blot檢測各氧化應(yīng)激模型組細胞內(nèi)SIRT1蛋白表達，各轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)SIRT1、FoxO3a蛋白表達。

RIPA裂解液提取總蛋白，加入SDS-PAGE凝膠加樣孔進行電泳，使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，TBST溫和洗膜3 min后加入相對應(yīng)的一抗：Nrf2(1∶1 000)、γ-GCS(1∶500)、HO-1(1∶1 000)，54℃孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次，加入相應(yīng)二抗(1∶2 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次，加入配制好的ECL發(fā)光液，避光孵育5 min，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中采集圖片信息，圖片用Image pro plus 6.0軟件進行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白條帶灰度。每個實驗結(jié)果獨立重復(fù)3次。

1.2.6 T-AOC、SOD、GSH-PX及MDA活性的檢測 采用相應(yīng)試劑盒說明書中的步驟測定各氧化應(yīng)激模型組細胞及各轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)T-AOC、SOD、GSH-PX、GSH和MDA活性。每個實驗結(jié)果獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激模型HLEB-3細胞中miR-211和SIRT1表達 與0、10、20、40 mmol/L葡萄糖共培養(yǎng)48 h后，HLEB-3細胞中miR-211的表達隨著葡萄糖濃度的升高而增加，SIRT1的表達隨著葡萄糖濃度的升高而降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(FmiR-211=7.271,P<0.001；FSIRT1=10.571,P<0.001)。見圖1。

注：A、B：RT-PCR檢測HLEB-3細胞中miR-211相對表達量；C、D：Western blot檢測HLEB-3細胞中SIRT1相對表達量。*與0 mmol/L組比較 P<0.05；△與10mmol/L組比較 P<0.05；▲與20 mmol/L組比較P<0.05

2.2 氧化應(yīng)激模型HLEB-3細胞中T-AOC、SOD、GSH-PX、MDA濃度 與0、10、20、40 mmol/L葡萄糖共培養(yǎng)48 h后，HLEB-3細胞中T-AOC、SOD和GSH-PX濃度隨葡萄糖濃度的升高而降低，MDA濃度隨著葡萄糖濃度的升高而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 葡萄糖所致氧化應(yīng)激模型HLEB-3細胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平 d

2.3 不同轉(zhuǎn)染組HLEB-3細胞中T-AOC、SOD、GSH-PX、MDA濃度 不同轉(zhuǎn)染組細胞與葡萄糖40 mmol/L葡萄糖共培養(yǎng)48 h后，miR-211 inhibitor組細胞內(nèi)T-AOC、SOD、GSH-PX濃度顯著高于miR-211 NC組，MDA濃度顯著低于miR-211 NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同轉(zhuǎn)染組HLEB-3細胞在葡萄糖所致氧化應(yīng)激模型中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平

2.4 不同轉(zhuǎn)染組HLEB-3細胞中SIRT1、FoxO3a蛋白表達 不同轉(zhuǎn)染組細胞與葡萄糖40 mmol/L葡萄糖共培養(yǎng)48 h后，miR-211 inhibitor組細胞內(nèi)SIRT1蛋白表達顯著高于miR-211 NC組(t=15.641,P=0.000)，F(xiàn)oxO3a蛋白表達顯著低于miR-211 NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.823,P=0.000)。見圖2。

注：*與miR-211 NC組比較P<0.05

3 討論

LECs是晶狀體代謝最活躍的部位，可產(chǎn)生晶狀體纖維，維持整個晶狀體的代謝，對維持晶狀體的透明性有重要作用[7]。miRNA在白內(nèi)障中的作用越來越受到關(guān)注，miR-211是近年來廣泛研究的一個miRNA，研究證實，miR-30a對視網(wǎng)膜病變和白內(nèi)障的發(fā)生有調(diào)控作用：Zeng[6]和Lu[8]等報道，miR-211在糖尿病性白內(nèi)障晶狀體組織中呈高表達，在高糖誘導(dǎo)的HLEB-3細胞氧化應(yīng)激模型中，miR-211呈現(xiàn)高表達，miR-211能促進LECs的凋亡，抑制其增殖；本研究檢測了miR-30a在與高糖共培養(yǎng)的LECs中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過葡萄糖刺激后，HLEB-3細胞內(nèi)miR-30a表達隨著葡萄糖濃度的升高而降低，這一結(jié)果與文獻報道一致，提示miR-211在糖尿病性白內(nèi)障中可能作為致病基因發(fā)揮作用。

糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病與晶狀體抗氧化應(yīng)激體系的紊亂有關(guān)。高糖環(huán)境誘導(dǎo)的LECs發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)是高糖引起的晶狀體渾濁的原因之一[9]，晶狀體細胞內(nèi)大量產(chǎn)生自由基，同時抗氧化酶如SOD、GSH-PX、T-AOC等的含量降低，細胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物如MDA堆積導(dǎo)致細胞毒性損傷，造成細胞凋亡[10-11]。本研究用不同濃度的葡萄糖與HLEB-3細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的增加，HLEB-3細胞MDA質(zhì)量濃度隨之增加，SOD、CAT、GSH-Px的活性隨之下降，這一結(jié)果與預(yù)測結(jié)果一致，證實高糖環(huán)境能誘導(dǎo)LECs發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究將轉(zhuǎn)染miR-211 inhibitor和miR-211 NC的HLEB-3細胞與葡萄糖共培養(yǎng)后，miR-211 inhibitor組細胞SOD、CAT、GSH-Px的活性高于miR-211 NC組，MDA質(zhì)量濃度低于miR-211 NC組，說明miR-211能增加高糖環(huán)境下HLEB-3細胞的氧化應(yīng)激損傷。

沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(silent information regulator, SIRT1)能通過組蛋白脫乙?；饔谜{(diào)節(jié)下游叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box O, FOXOs)等轉(zhuǎn)錄因子的活性，減輕內(nèi)皮細胞線粒體損傷，減緩內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷[12-13]。有報道證實，SIRT1在糖尿病性白內(nèi)障小鼠LECs中的表達的下調(diào)[13]；FoxO3a是FOX家族成員，在氧化應(yīng)激環(huán)境中，SIRT1通過去乙?；疐oxO3a進而通過泛素化作用降解FoxO3a，抑制其誘導(dǎo)細胞死亡的能力，最終實現(xiàn)保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷[14]。有研究證實，高糖處理后，LECs中的FoxO3a蛋白表達以劑量和時間依賴性方式升高[15]，F(xiàn)oxO3a可以作為高血糖條件下人LECs氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著氧化應(yīng)激模型HLEB-3細胞中miR-211表達的增高，SIRT1的蛋白表達隨之降低，同時，轉(zhuǎn)染了miR-211 inhibitor的細胞中，SIRT1的表達高于轉(zhuǎn)染miR-211 NC的細胞，而FoxO3a的表達低于轉(zhuǎn)染miR-211 NC的細胞，提示SIRT1可能是miR-211 的一個靶基因，miR-211對高糖誘導(dǎo)下LECs氧化應(yīng)激的調(diào)控作用可能是通過抑制SIRT1的表達而實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-211能降低高糖誘導(dǎo)下晶狀體上皮細胞的抗氧化應(yīng)激能力，這一過程可能是通過抑制SIRT1的表達而實現(xiàn)的。