microRNA-125b在孕期酒精暴露所致新生小鼠腦神經(jīng)元凋亡中的作用*

胡文廣, 趙力立, 鄧佳, 毛丹丹, 李思秀

成都市婦女兒童中心醫(yī)院兒童神經(jīng)內(nèi)科(四川成都 610091)

盡管長期以來學(xué)者對飲酒對于人體的影響一直存在爭議，但孕期酒精暴露對子代發(fā)育的危害已為人所熟知。孕期母親飲酒會導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)胎兒酒精綜合征(fetal alcohol syndrome, FAS)[1]。FAS的最主要影響是其對子代神經(jīng)系統(tǒng)的破壞。宮內(nèi)酒精暴露可影響神經(jīng)細(xì)胞功能，甚至影響腦部結(jié)構(gòu)的發(fā)育而引起腦畸形，進(jìn)而引發(fā)一連串的認(rèn)知功能障礙，包括有記憶力低下、注意力不足、沖動的行為及較差的理解力等，另外亦會造成次級障礙，如對法律感到困難、心理疾病及藥物上癮[2]。近期研究顯示在不知已受孕情況下，孕早期的酒精單次暴露同樣可對子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生諸多負(fù)面影響。因此探討孕期酒精暴露的保護(hù)性因素至關(guān)重要。目前認(rèn)為孕期酒精暴露致子代發(fā)育異常與細(xì)胞凋亡可能有關(guān)。然而具體機(jī)制研究仍有較大空白。microRNA是近些年發(fā)現(xiàn)的與基因沉默、下調(diào)密切相關(guān)的一類非編碼小分子RNA[3-5]。最新研究發(fā)現(xiàn)microRNA-125b(miR125b)在哺乳動物腦組織中存在高豐都表達(dá)，其為新近發(fā)現(xiàn)的參與神經(jīng)細(xì)胞代謝、凋亡的重要非編碼RNA[6]。目前p53在凋亡中的關(guān)鍵作用已為學(xué)者所熟知，通過調(diào)控Bax/Bcl2、Fas/Apol及IGF-BP3 等蛋白，p53可直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。同時最新研究發(fā)現(xiàn)miR125b可負(fù)向調(diào)控p53基因表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控多種生理、病理過程[6]。而miR125b-p53通路在FAS中的作用尚無報道。因此我們推測在孕期酒精暴露模型中，miR125b可能通過負(fù)向調(diào)控p53而致子代神經(jīng)細(xì)胞凋亡。2017年10月至2019年6月，本研究通過構(gòu)建FAS動物模型，以microRNA調(diào)控為研究切入點，探討孕期酒精暴露致子代神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 c57受孕雌性鼠(購于四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心)。

1.1.2 PC-12細(xì)胞培養(yǎng)及miR125b過表達(dá)轉(zhuǎn)染 PC-12細(xì)胞株采購普賽諾(武漢)生物科技有限公司。miR125b-mimic由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.1.3 主要試劑 抗p53抗體；工作濃度1∶3 000；抗Bax抗體，工作濃度1∶3 000；抗GPADH鼠單克隆抗體，工作濃度1∶2 000；山羊抗兔及山羊抗小鼠帶HRP標(biāo)記的IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒(Pierce公司)；總RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；實時定量PCR試劑盒(天根生化技術(shù)有限公司);Tunnel 試劑盒(羅氏公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠分組及處理 小鼠隨機(jī)分為兩組，整個孕期連續(xù)予以5 μL/g/d，50%的酒精連續(xù)灌胃19 d作為酒精暴露組，生理鹽水灌胃作為對照組。新生小鼠采用CO2窒息處死，隨即開顱取出全腦組織。

1.2.2 PC-12細(xì)胞體外培養(yǎng) PC-12細(xì)胞復(fù)蘇后在含神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)5 d以獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞。給予濃度100 mmol/L乙醇暴露神經(jīng)元樣細(xì)胞，36 h后轉(zhuǎn)染miR125b-mimic。

1.2.3 檢測小鼠出生腦/體重比 子代小鼠生后即測其出生體重，單位以克(g)計，新生小鼠全腦組織稱重，單位以毫克(mg)計，計算腦/體重比。

1.2.4 Tunnel檢測新生鼠腦組織細(xì)胞凋亡 收集新生小鼠腦組織每組3個，4%多聚甲醛固定-30%蔗糖脫水處理-OCT包埋-冰凍切片。按照Tunnel試劑盒說明書步驟染色組織切片，熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞核被DAPI標(biāo)記為藍(lán)色熒光，Tunnel陽性細(xì)胞被標(biāo)記為綠色熒光。我們隨機(jī)選取5個切面，對于切面內(nèi)凋亡細(xì)胞及總細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞比，再進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.5 Western blot檢測p53及Bax蛋白 冰浴下迅速取出全腦組織，放入PBS中清洗，盡量除去殘留血液，存于液氮中備用。收集腦組織后，利用全蛋白提取試劑盒，提取全蛋白，調(diào)整上樣量為30 μg，點樣在10%的SDS-聚丙酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，再電轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜上，用封閉液稀釋Ⅰ抗后4℃過夜，洗膜后再孵育Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)，室溫下后洗膜，化學(xué)發(fā)光成像，Quantity one軟件獲得其吸光度，以目的蛋白/GAPDH(吸光度值)來反映蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.6 實時定量PCR 按照試劑盒說明書操作進(jìn)行實時定量PCR檢測。p53上游引物序列為：5′-CAAGCTTATGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCA-3′，下游引物序列為：5′-TCTCGAGTCAGTCTGAGTCAGGCCC-3′，產(chǎn)物長度為154 bp；Bax的上游引物序列為5′-GAGCATCTTTGCGATTACC-3′，下游引物序列為5′-GTTATTGACAACGAGGCAT-3′，產(chǎn)物長度為132 bp；miR125b的上游引物序列為5′-CATTCGTACAGCCGT-3′，下游引物序列為5′-ACGTTCGGGTGTG-3′，產(chǎn)物長度為109 bp；選取U6作為microRNA內(nèi)參基因，上游引物序列為5′-GTACCGTTCATATC-3′, 下游引物序列為5′-GATTCGATCCGAC-3′，產(chǎn)物長度114 bp；選取GAPDH作為內(nèi)參基因。所得數(shù)據(jù)用Bio-RadCFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl 原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 子代小鼠出生腦/體重比 對照組小鼠出生腦/體重比為(5.32±1.06)mg/g，而酒精暴露組小鼠出生腦/體重比為(4.19±0.87)mg/g，孕期酒精暴露引起子代小鼠腦/體重比明顯下降，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 子代小鼠腦組織Tunel陽性細(xì)胞情況 發(fā)現(xiàn)孕期酒精暴露后新生小鼠腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯增多(1.4%vs0.08%)。見圖1。

注：A：酒精暴露組；B：對照組。C：隨機(jī)切面視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)比值，*與對照組比較 P<0.01(n=5)。細(xì)胞核被DAPI標(biāo)記為藍(lán)色熒光，Tunnel陽性細(xì)胞被標(biāo)記為綠色熒光

2.3 子代小鼠腦組織中miR125b、p53及Bax mRNA表達(dá)水平 酒精暴露組F1代小鼠腦組織中miR125b mRNA較對照組降低(P<0.05)，而p53及Bax的mRNA表達(dá)在酒精暴露組中顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 酒精暴露組與對照組各基因mRNA相對表達(dá)量

2.4 子代小鼠腦組織中p53及Bax蛋白表達(dá)水平 酒精暴露組子代小鼠腦組織p53及Bax蛋白水平較對照組均顯著升高(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 兩組p53及Bax蛋白表達(dá)水平

注：A：兩組p53蛋白表達(dá)水平比較；B：兩組Bax 蛋白表達(dá)水平比較

2.5 體外情況下乙醇干預(yù)PC-12細(xì)胞及miR125b-mimic轉(zhuǎn)染后miR125b、p53及Bax mRNA表達(dá)水平 100 mmol/L乙醇干預(yù)神經(jīng)元樣細(xì)胞后檢測miR125b、p53及Bax的mRNA表達(dá)水平；與體內(nèi)結(jié)果相似，miR125b mRNA較對照組降低(P<0.05)，而p53及Bax的mRNA表達(dá)在酒精暴露組中顯著升高(P<0.05)，見表3；將構(gòu)建好的miR125b-mimic轉(zhuǎn)染乙醇干預(yù)的神經(jīng)元樣細(xì)胞后，再次檢測miR125b、p53及Bax的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR125b后，與酒精暴露組及對照組相比miR125b表達(dá)顯著升高(P<0.05)，與酒精暴露組相比p53及Bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組各基因mRNA相對表達(dá)量

3 討論

FAS包括子代出生低體重、神經(jīng)及心臟發(fā)育畸形等多種發(fā)育異常[1]。我們數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)子代新生小鼠在出生時即存在腦體質(zhì)比的顯著下降。而凋亡是酒精致子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的重要機(jī)制之一[8]。本研究通過構(gòu)建FAS小鼠模型，探討FAS中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。

microRNA在哺乳動物進(jìn)化中高度保守[9-10]，其通過降解靶基因mRNA而調(diào)控基因沉默[11]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸多與神經(jīng)發(fā)育生理、病理相關(guān)的microRNA[11-12 ]。miR125b是新近發(fā)現(xiàn)的一種在腦組織中高豐度表達(dá)的microRNA[6]。然而其是否參與影響FAS中神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常仍不明確。本研究首次在FAS模型中檢測并發(fā)現(xiàn)miR125b在FAS小鼠腦組織中表達(dá)明顯降低。提示其靶基因可能過度激活而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。而我們通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)p53是新近發(fā)現(xiàn)miR125b下游基因[6]。如前述，凋亡是FAS發(fā)生中的重要一環(huán)，而p53恰為經(jīng)典的凋亡相關(guān)基因。諸多文獻(xiàn)已經(jīng)證實，p53可直接激活其下游促凋亡基因Bax而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-14]，此過程在腫瘤發(fā)生、腦血管梗死等多種生理、病理過程發(fā)揮重要作用[15-16]。因此我們進(jìn)一步檢測了FAS小鼠腦組織中p53及其下游凋亡基因Bax的表達(dá)。我們結(jié)果提示p53-Bax通路的上調(diào)可能是FAS小鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的重要發(fā)生機(jī)制。

為了進(jìn)一步驗證miR125b-p53-Bax通路在FAS神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用，我們進(jìn)一步設(shè)計了細(xì)胞學(xué)實驗，通過過表達(dá)miR125b以期明確其對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR125b后，神經(jīng)細(xì)胞中p53及Bax表達(dá)均有明顯下降，明確了miR125b-p53-Bax通路在FAS神經(jīng)元細(xì)胞凋亡發(fā)生中的重要作用。另一方面，鑒于microRNA類小分子可通過胎盤[17]，現(xiàn)已有多個研究提示microRNA可作為諸多疾病的診斷標(biāo)志物[18-21]。因此我們的研究同時為FAS提供了潛在預(yù)警標(biāo)志物及可能的干預(yù)靶點。

綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)了FAS模型小鼠腦組織中存在miR125b表達(dá)下調(diào)，而其下調(diào)直接影響p53-Bax通路所介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但miR125b下游靶基因眾多，其是否可對其他通路基因產(chǎn)生影響，進(jìn)而促進(jìn)FAS中神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的發(fā)生有待進(jìn)一步探討。