大蒜粉蒜酶活力的測定方法研究

胡小霞,肖文浚,宋百靈,,李蘭蘭,王 艷，史榮梅*

(1.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，新疆 烏魯木齊 830013； 2.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011)

大蒜(AlliumsativumL.)作為一種古老的藥食兩用植物，具有解毒消腫、殺蟲、止痢等功效，常用于治療癰腫瘡瘍、疥癬、肺癆、頓咳、泄瀉、痢疾等[1]。大蒜辣素是目前公認的大蒜最重要的活性成分[2-5]，然而完整大蒜本身并不含大蒜辣素，只有當其被切割或破碎時，分處細胞不同部位的蒜氨酸與蒜酶相遇，蒜酶迅速催化裂合蒜氨酸從而產生大蒜辣素。

大蒜粉是新鮮大蒜鱗莖經切制、凍干或低于65 ℃干燥、粉碎后制得，其不僅可以保留大蒜除水分以外的原始成分，包括蒜氨酸和具有活力的蒜酶，還較新鮮大蒜更易于運輸、儲存和質量控制。大蒜粉已被英國藥典[6]、美國藥典[7]和歐洲藥典[8]收載，其中英國藥典和歐洲藥典將潛在大蒜辣素含量作為大蒜粉的質控指標，該指標同時顯示了蒜氨酸含量及蒜酶活力。大蒜辣素的前體物質是蒜氨酸，蒜氨酸轉化為大蒜辣素的轉化率與蒜酶活力密切相關。蒜酶是一種二聚體糖蛋白酶，對溫度、壓力極為敏感。因此，在大蒜粉的制備工藝中，關鍵技術是對蒜酶活力的保留，它決定了最終大蒜辣素的轉化程度。

蒜酶活力測定的常見方法有丙酮酸法[9-10]、乳酸脫氫酶法[11]、4-巰基吡啶法[12]、2-硝基-5-硫代苯甲酸法[13]等，而大蒜粉蒜酶活力的測定方法鮮有報道。作者所在課題組[14-15]經過前期大量研究，確定蒜酶最適反應溫度為35 ℃、溶液最適pH值為7.0。蒜酶可與蒜氨酸反應生成大蒜辣素和丙酮酸，丙酮酸與2,4-二硝基苯肼在堿性環(huán)境中可生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，在一定濃度范圍內丙酮酸的量與吸光度呈線性關系。因此，作者建立了紫外可見分光光度法測定大蒜粉的蒜酶活力，對顯色條件進行優(yōu)化，并進行方法學驗證，以期對大蒜粉的生產工藝進行評價。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

大蒜粉(共10批)，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司。

丙酮酸鈉(>99%)、磷酸吡哆醛，生化試劑，西格瑪奧德里奇貿易有限公司；2,4-二硝基苯肼，生化試劑，上海索萊寶生物科技有限公司；蒜氨酸(90%)，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司；鹽酸、三氯乙酸，分析純，成都科龍化工試劑廠；磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀，分析純，天津致遠化學試劑有限公司；氯化鈉，分析純，天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；氫氧化鈉，分析純，天津永晟精細化工有限公司。

UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司；AB135-S型分析天平，梅特勒-托利多；5424R型低溫離心機，德國艾本德。

1.2 溶液的配制

磷酸鹽緩沖液(pH 值7.0)：取磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀適量，加水溶解并定容于1 000 mL容量瓶中。臨用前每100 mL溶液加磷酸吡哆醛溶液(1 mmol·L-1)2.5 mL，即得。

丙酮酸鈉標準溶液：取丙酮酸鈉適量，加磷酸鹽緩沖液制成1 μmol·mL-1的丙酮酸鈉標準溶液。

蒜氨酸溶液：取蒜氨酸適量，加磷酸鹽緩沖液制成10 mmol·L-1蒜氨酸溶液。

供試溶液：精密稱取大蒜粉15 mg，置于50 mL容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液溶解并定容至刻度，搖勻，12 000 r·min-1離心(4 ℃)5 min；取上清液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得，于0～4 ℃保存。

供試酶滅活溶液：取供試溶液5 mL，置于水浴中煮沸5 min，即得。

1.3 檢測波長的確定

取丙酮酸鈉標準溶液80 μL，加磷酸鹽緩沖液至0.8 mL，加10%三氯乙酸0.8 mL、2,4-二硝基苯肼溶液0.4 mL，搖勻，室溫放置9 min；加氫氧化鈉溶液2.0 mL，搖勻，室溫放置5 min；以磷酸鹽緩沖液代替丙酮酸鈉標準溶液，同法操作，作為空白對照，在300～800 nm區(qū)間進行光譜掃描。

1.4 大蒜粉蒜酶活力的測定

取供試溶液0.4 mL、蒜氨酸溶液0.4 mL，分別于(35±0.5) ℃水浴中預熱3 min，混合后于(35±0.5) ℃水浴反應5 min，立即加10%三氯乙酸0.8 mL，搖勻，加2,4-二硝基苯肼溶液0.4 mL，按1.3方法測定520 nm處吸光度。另以供試酶滅活溶液代替供試溶液，同法測定520 nm處吸光度。根據(jù)單位時間丙酮酸的生成量按下式計算大蒜粉蒜酶活力(U·g-1)：

式中：c為測得的丙酮酸濃度，μmol·mL-1；c0為供試品中本底水平丙酮酸濃度，μmol·mL-1；n為供試溶液稀釋倍數(shù)；t為反應時間，t=5 min；m為大蒜粉稱樣量，g。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

丙酮酸鈉與2,4-二硝基苯肼反應后，在堿性條件下于445 nm和520 nm處有吸收峰(圖1)。蒜酶與輔酶磷酸吡哆醛結合可形成席夫堿[16]，在430 nm附近有弱的吸收峰，為避免干擾，選擇520 nm作為檢測波長。

2.2 顯色條件的優(yōu)化

2.2.1 2,4-二硝基苯肼溶液濃度的選擇

取丙酮酸鈉標準溶液80 μL，加磷酸鹽緩沖液至0.8 mL，加10%三氯乙酸0.8 mL，分別加不同濃度的2,4-二硝基苯肼溶液0.4 mL，按1.3方法測定520 nm處吸光度，結果見圖2。

由圖2可以看出，2,4-二硝基苯肼溶液濃度在1.0～4.0 mmol·L-1時，吸光度呈上升趨勢；2,4-二硝基苯肼溶液濃度在5.0～10.0 mmol·L-1時，吸光度基本穩(wěn)定。綜合考慮，確定2,4-二硝基苯肼溶液濃度為5.0 mmol·L-1。

圖1 丙酮酸鈉與2,4-二硝基苯肼反應液的UV-Vis吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of reaction solution of sodium pyruvate with 2,4-dinitrophenylhydrazine

圖2 2,4-二硝基苯肼溶液濃度對吸光度的影響Fig.2 Effect of concentration of 2,4-dinitrophenylhydrazine solution on absorbance

2.2.2 反應時間的選擇

取丙酮酸鈉標準溶液80 μL，加磷酸鹽緩沖液至0.8 mL，加10%三氯乙酸0.8 mL、2,4-二硝基苯肼溶液0.4 mL，搖勻，在室溫分別放置一定時間，按1.3方法測定520 nm處吸光度，結果見圖3。

圖3 反應時間對吸光度的影響Fig.3 Effect of reaction time on absorbance

由圖3可以看出，丙酮酸鈉與2,4-二硝基苯肼溶液反應3～4 min時，吸光度明顯上升；反應4～9 min時，吸光度緩慢上升；之后延長反應時間，吸光度幾乎無變化。因此，確定反應時間為9 min。

2.2.3 氫氧化鈉溶液濃度的選擇

取丙酮酸鈉標準溶液80 μL，加磷酸鹽緩沖液至0.8 mL，加10%三氯乙酸0.8 mL、2,4-二硝基苯肼溶液0.4 mL，搖勻，室溫放置9 min，分別加不同濃度的氫氧化鈉溶液2.0 mL，按1.3方法測定520 nm處吸光度，結果見圖4。

圖4 氫氧化鈉溶液濃度對吸光度的影響Fig.4 Effect of concentration of sodium hydroxide solution on absorbance

由圖4可以看出，隨著氫氧化鈉溶液濃度的增加，吸光度迅速上升；當氫氧化鈉溶液濃度為2.0～2.5 mol·L-1時，吸光度較穩(wěn)定；繼續(xù)增加氫氧化鈉溶液濃度，吸光度呈下降趨勢。因此，確定氫氧化鈉溶液濃度為2.5 mol·L-1。

2.2.4 顯色時間的選擇

取丙酮酸鈉標準溶液0.8 mL，加磷酸鹽緩沖液至8 mL，加10%三氯乙酸8 mL、2,4-二硝基苯肼溶液4 mL，搖勻，室溫放置9 min，加氫氧化鈉溶液20 mL，搖勻，室溫放置一定時間，按1.3方法測定520 nm處吸光度，結果見圖5。

圖5 顯色時間對吸光度的影響Fig.5 Effect of coloration time on absorbance

由圖5可以看出，加氫氧化鈉溶液顯色后，在5～30 min內，吸光度基本無明顯變化。因此，確定顯色時間為5 min。

2.3 方法學考察

2.3.1 丙酮酸鈉的線性范圍

取丙酮酸鈉標準溶液，加磷酸鹽緩沖液配制成濃度為0.05 μmol·mL-1、0.10 μmol·mL-1、0.20 μmol·mL-1、0.30 μmol·mL-1、0.40 μmol·mL-1、0.50 μmol·mL-1系列丙酮酸鈉溶液。取上述系列丙酮酸鈉溶液0.8 mL，加10%三氯乙酸0.8 mL、2,4-二硝基苯肼溶液0.4 mL，按1.3方法測定520 nm處吸光度。以丙酮酸鈉濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程y=12.29x+5.63×10-3，R2=0.9999。表明，丙酮酸鈉濃度在0.01～0.10 μmol·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.3.2 精密度

精密稱取大蒜粉約15 mg，共6份，按1.2方法配制成供試溶液，按1.4方法測定蒜酶活力。測得供試溶液蒜酶活力的RSD為1.9%，符合要求。

2.3.3 加標回收率

精密稱取大蒜粉約12.5 mg，共9份，分別置于50 mL容量瓶中，分為3組，依次加丙酮酸鈉11.0 mg、13.8 mg、16.5 mg，按1.2方法配制成低、中、高濃度加標樣，按1.4方法測定蒜酶活力。測得蒜酶活力平均加標回收率為98.1%，RSD為1.8%(n=9)(表1)。

表1 加標回收率測定結果

2.3.4 溶液穩(wěn)定性

精密稱取大蒜粉約15 mg，按1.2方法配制成供試溶液，于0～4 ℃分別保存1 h、2 h、4 h、6 h、8 h，按1.4方法測定蒜酶活力。結果表明，在0～4 ℃保存8 h內，供試溶液蒜酶活力的RSD為1.6%，穩(wěn)定性良好。但蒜酶活力易受溫度等因素影響，建議臨用新配。

2.4 樣品測定

測定不同批次大蒜粉的蒜酶活力。結果表明，不同批次大蒜粉的蒜酶活力差異較明顯(表2)。

表2 大蒜粉蒜酶活力的測定結果

2.5 討論

大蒜粉成分較為復雜，本研究扣除其本身含有蒜氨酸反應生成的丙酮酸，再加入蒜氨酸底物與蒜酶反應，通過測定丙酮酸的生成量計算蒜酶活力。大蒜粉中蒜氨酸還可轉化為大蒜辣素，而大蒜辣素對蒜酶活力有一定的抑制作用。考慮到不同大蒜粉中蒜氨酸含量的差異可能會對蒜酶活力測定結果產生影響，故設計實驗，通過外加蒜氨酸將大蒜粉中蒜氨酸含量拉至同等水平后，再進行蒜酶活力測定。實驗結果與上述測定結果(表2)保持一致，大蒜粉中蒜氨酸含量的差異對蒜酶活力的測定無影響。說明大蒜粉中蒜氨酸所轉化的大蒜辣素不足以抑制蒜酶活力，故本研究方法可用于不同蒜氨酸含量的大蒜粉蒜酶活力的評價。

3 結論

建立了紫外可見分光光度法測定大蒜粉的蒜酶活力，對顯色條件進行優(yōu)化，并進行方法學驗證。結果表明，最佳顯色條件為：2,4-二硝基苯肼溶液濃度為5.0 mmol·L-1、反應時間為9 min、氫氧化鈉溶液濃度為2.5 mol·L-1、顯色時間為5 min。丙酮酸鈉濃度在0.01～0.10 μmol·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好(R2=0.9999)，蒜酶活力的平均加標回收率為98.1%(RSD=1.8%，n=9)。該方法穩(wěn)定可靠、精密度好、準確度高，可用于不同蒜氨酸含量大蒜粉的蒜酶活力測定，對大蒜粉制備工藝的控制具有重要應用價值。