槲寄生聯(lián)合遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)對缺血再灌注心肌保護(hù)作用的影響

欒海蓉 代海兵 魏 韜 李 麗 王得利

牡丹江醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)教研室，黑龍江牡丹江 157011

缺血的組織器官恢復(fù)血流灌注后，不但不能使其功能和結(jié)構(gòu)恢復(fù)，反而加重其功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象稱為缺血-再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，I/RI）[1-5]。槲 寄 生[拉 丁 學(xué) 名：Viscum coloratum（Kom.）Nakai]是我國的傳統(tǒng)中藥，對心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用[6-7]。遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)（remote ischemic post-conditioning，RIPOC）是近年提出的減少器官組織I/RI的比較新的理論和方法，RIPOC操作無創(chuàng)、簡單易行，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[8-12]。本研究通過建立大鼠I/RI的模型，將槲寄生有效提取物和RIPOC聯(lián)合應(yīng)用，探究兩種干預(yù)措施對I/RI心肌的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年雄性SD大鼠50只，8～10周齡，體重250～300 g，牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號 SYXK（黑）2019-006。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照動物倫理要求處置實(shí)驗(yàn)動物。

1.2 藥品、試劑與儀器

槲寄生有效提取物的制備方法見文獻(xiàn)[13]。10%水合氯醛（300 mg/kg，上海山浦化工有限公司），CK試劑盒、CK-MB試劑盒、LDH試劑盒（南京建成生物工程生物公司）。BL-420E多功能生物信號采集系統(tǒng)、HX-100E小動物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 建立心肌缺血再灌注損傷（I/RI）模型

10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉SD大鼠，仰臥位固定。連接BL-420E多功能生物信號采集系統(tǒng)，持續(xù)監(jiān)測心電圖（electrocardiogram，ECG）Ⅱ?qū)?lián)及心率（HR）變化。頸胸部備皮，消毒，行氣管插管術(shù)，連接小型動物呼吸機(jī)進(jìn)行人工通氣。

左側(cè)胸前術(shù)區(qū)沿第4肋骨向腋窩走行方向切開皮膚，鈍性分離肋間肌層2～3 cm，進(jìn)入胸腔，迅速將心臟擠出胸腔，識別冠狀動脈左前降支（left anterior descending，LAD），并用 6-0不可吸收縫合線將其結(jié)扎。縫線打結(jié)時(shí)放置一根“10”號絲線協(xié)助壓迫造成心肌缺血，30 min后剪斷線結(jié)行再灌注 120 min。I/RI模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：心電圖ST段抬高和（或）T弓背向上，左室前壁顏色逐漸變白，表示造模成功。

1.4 分組及干預(yù)給藥

50只SD大鼠 隨機(jī)分為5組，每組各10只：①Sham組：LAD下方穿線不結(jié)扎，連續(xù)觀察 150 min。②I/RI組：冠脈結(jié)扎30 min后再灌注 120 min。③槲寄生組：灌胃給予槲寄生有效提取物（300 mg/kg），1 次 /d，連續(xù)14 d，最后一次結(jié)束后結(jié)扎冠狀動脈，30 min后剪斷絲線復(fù)灌120 min。④RIPO組：冠狀動脈結(jié)扎30 min后，對大鼠左后肢使用止血帶做3周期5 min缺血/5 min 再灌注處理，然后復(fù)灌120 min。⑤聯(lián)合組（槲寄生+RIPOC組）：每日灌胃給藥同槲寄生組，最后一次結(jié)束后結(jié)扎冠狀動脈造成心肌缺血30 min后，再進(jìn)行RIPOC干預(yù)，最后復(fù)灌120 min。Sham組、I/RI組與 RIPOC 組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液，均持續(xù)干預(yù) 14 d。

1.5 觀察指標(biāo)

監(jiān)測血流動力學(xué)及ECG變化：全程監(jiān)測并記錄開胸前基礎(chǔ)值（T0），缺血10min（T1），缺血30 min（T2），再灌注30 min（T3），再灌注60 min（T4），再灌注120 min（T5）不同時(shí)間段的HR和平均動脈壓（MAP）。

血清生化指標(biāo)測定：再灌注120 min后，靜脈采血1～2 ml，置于抗凝試管并靜置室溫20 min后，離心機(jī)上3500 轉(zhuǎn)/min，離心10 min后吸取上清血清置入滅菌離心管中，并保存于-20℃冰箱中，測定血清血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶心肌型同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）、乳酸脫氧酶（iactic dehydrogenase，LDH）含量。

心肌梗死程度：收集血液標(biāo)本后，迅速打開胸腔再次結(jié)扎LAD，經(jīng)頸內(nèi)靜脈注入1%伊文氏藍(lán)1～2 ml染色（正常心肌被染成藍(lán)色，缺血心肌不著色）。3 min 后將心臟剪下，-20℃冰箱冰凍1 h后，切成1.0～2.0 mm厚的薄片，置于1% TTC中，37℃溫育 30 min。其中白色部位表示心肌梗死區(qū)（infarct size，IS），紅色和白色代表心肌缺血區(qū)（area at rist，AAR），藍(lán)色表示正常心肌組織即非缺血區(qū)，LV代表左心室（left ventricle，LV）。吸干水分后稱取各區(qū)重量。缺血程度用缺血區(qū)重量/左心室重量（AAR/LVg）表示；梗死程度用梗死區(qū)重量/缺血區(qū)重量（IS/AARg）表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有資料均采取SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)HR的比較

I/RI組與各干預(yù)組大鼠的HR隨時(shí)間推移均有所下降（P＜0.01）。T1至T5時(shí)刻，與 Sham 組比較，I/RI 組HR降低明顯（P＜0.01）；與I/RI 組比較，T2至T5時(shí)刻，各干預(yù)組HR相對較高（P＜0.05，P＜0.01）；T3至T5，聯(lián)合組大鼠的HR高于槲寄生組和RIPOC組（P＜0.01）。見表 1。

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MAP的比較

T2至T5時(shí)刻，與 Sham 組比較，I/RI組血壓明顯下降（P＜0.01）；與 I/RI組比較，T2至T5時(shí)刻，各干預(yù)組大鼠血壓相對較高（P＜0.01）。T3至T5時(shí)刻，聯(lián)合組大鼠的血壓高于槲寄生組和RIPOC組（P＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的HR比較（±s，次/min）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的HR比較（±s，次/min）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與I/RI組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與聯(lián)合組比較，dP＜0.01

組別 n T0 T1 T2 T3 T4 T5 F值 P值Sham 組 10 386±9 380±4 391±10 390±6 388±11 382±3 2.347 ＞0.05 I/RI組 10 389±12 364±10a 361±3a 358±2a 361±8a 339±9a 29.480 ＜0.01槲寄生組 10 388±11 362±10 362±3b 370±4cd 368±5bd 356±4cd 17.460 ＜0.01 RIPOC組 10 387±11 362±7 365±4b 372±7cd 369±6bd 358±8cd 14.744 ＜0.01聯(lián)合組 10 386±9 361±4 368±8b 383±11c 377±5c 370±4c 13.159 ＜0.01 F值 0.169 34.975 11.109 32.509 19.451 73.917 P值 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的MAP比較（±s，mmHg）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的MAP比較（±s，mmHg）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與I/RI組比較，bP＜0.01；與聯(lián)合組比較，cP＜0.01

組別 n T0 T1 T2 T3 T4 T5 F值 P值Sham 組 10 104±5 106±3 105±6 103±3 101±5 100±6 2.087 ＞0.05 I/RI組 10 107±3 108±2 96±4a 75±3a 77±4a 65±3a 270.607 ＜0.01槲寄生組 10 105±4 110±3 100±3b 90±3bc 82±3bc 79±2bc 125.216 ＜0.01 RIPOC組 10 105±4 110±3 101±4b 88±5bc 85±4bc 82±3bc 71.578 ＜0.01聯(lián)合組 10 106±3 109±4 100±3b 95±3b 93±3b 88±5b 36.603 ＜0.01 F值 0.867 1.913 4.527 62.997 60.901 87.527 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 各組大鼠再灌注120 min后血清酶濃度比較（±s，U/L）

表3 各組大鼠再灌注120 min后血清酶濃度比較（±s，U/L）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與I/RI組比較，bP＜0.01；與聯(lián)合組比較，cP＜0.01

組別 n CK CK-MB LDH Sham 組 10 1033.52±72.77 192.55±28.40 312.79±29.82 I/RI組 10 12937.55±746.66a 1238.35±105.18a 1977.35±137.36a槲寄生組 10 8138.75±86.69bc 753.45±67.58bc 1105.72±83.56bc RIPOC組 10 8235.70±178.14bc 789.33±62.71bc 1059.13±59.35bc聯(lián)合組 10 6371.14±187.34b 592.35±42.60b 785.32±26.40b F值 1297.481 320.565 536.036 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 各組大鼠血清生化指標(biāo)的比較

與Sham組比較，I/RI組大鼠血清酶CK、CK-MB、LDH濃度均升高明顯（P＜0.01）。與I/RI組比較，各干預(yù)組大鼠的三種血清酶濃度均有所降低（P＜0.01）。聯(lián)合組大鼠的血清酶濃度低于槲寄生組和RIPOC組（P＜0.01）。見表3。

2.4 各組大鼠心肌缺血程度和梗死程度的比較

各組大鼠的心肌缺血程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與I/RI組比較，各干預(yù)組大鼠的梗死程度均明顯降低（P＜0.01）。聯(lián)合組梗死程度小于槲寄生組和RIPOC組（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠缺血程度和梗死程度比較（±s，%）

表4 各組大鼠缺血程度和梗死程度比較（±s，%）

注：與I/RI組比較，aP＜0.01；與聯(lián)合組比較，bP＜0.01

組別 n 缺血程度 梗死程度Sham 組 10 - -I/RI組 10 57.15±0.16 55.07±0.37槲寄生組 10 56.97±0.31 45.47±0.37ab RIPOC組 10 56.89±0.68 43.25±0.21ab聯(lián)合組 10 56.87±0.61 18.64±0.34a F值 0.684 22231.041 P值 ＞0.05 ＜0.01

3 討論

槲寄生是我國傳統(tǒng)常用中藥材[14-17]，其對心血管系統(tǒng)的作用已成為研究熱點(diǎn)。RIPOC作為一種非藥物治療方法，在冠脈溶栓、心臟手術(shù)等領(lǐng)域有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值[18-19]。結(jié)果顯示，在T2至T5時(shí)刻，與I/RI組相比，槲寄生、RIPOC或者二者聯(lián)合干預(yù)下，都能改善I/RI大鼠的HR，還可以平穩(wěn)血壓，聯(lián)合組效果優(yōu)于槲寄生組和RIPOC組。

CK-MB、CK、LDH 的血清濃度常作為心肌I/RI的診斷性標(biāo)志物，用來評價(jià)心肌細(xì)胞損傷程度[20-23]。結(jié)果顯示，I/RI組的 CK-MB、CK及 LDH濃度較缺血前明顯升高，說明I/RI對大鼠心肌細(xì)胞產(chǎn)生了嚴(yán)重的損傷；再灌注 120 min后，與I/RI組相比，槲寄生組和RIPOC組的CK、CK-MB及LDH 濃度明顯降低，均可減輕心肌細(xì)胞的損傷和壞死，聯(lián)合組大鼠的血清酶濃度明顯低于槲寄生組和RIPOC組。

心肌梗死程度的測定是評估心肌各種干預(yù)措施是否有效的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。與 I/RI組相比，槲寄生、RIPOC都能減輕心肌細(xì)胞的損傷，心肌梗死程度明顯減少，聯(lián)合組梗死程度最輕，明顯小于槲寄生組和RIPOC組。

綜上所述，槲寄生和RIPOC兩種干預(yù)方式聯(lián)合應(yīng)用，可以最大程度改善I/RI心肌的血流供應(yīng)，減少心肌酶的釋放，減少再灌注后心肌損傷，具有一定的協(xié)同保護(hù)作用。