低濃度含鉛細(xì)顆粒物暴露大鼠體內(nèi)生物轉(zhuǎn)運(yùn)研究

夏棟林 仇 昀 王鄉(xiāng)兒 陳 超 張小鑫 袁善美 顧海鷹 胡 勇

(1.南通大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南通 226019；2.南京大學(xué) 現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院，南京 210023；3.南通職業(yè)大學(xué) 江蘇 南通 226019)

前言

大氣細(xì)顆粒物(Particulate Matter，PM)是大氣中多種污染物的富集載體，成分復(fù)雜，尤其是存在許多重金屬(如鉛)。這些重金屬能夠以大氣細(xì)顆粒物的形式通過呼吸途徑進(jìn)入人體，并長(zhǎng)時(shí)間沉積。因這些顆粒物難以被生物降解，從而在人體中長(zhǎng)期不斷向血液釋放，甚至可以穿過血腦屏障對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成影響。特別是長(zhǎng)時(shí)間干擾人體內(nèi)蛋白質(zhì)及酶的功能，造成慢性損傷。

鉛是人類環(huán)境中接觸最頻繁的有毒重金屬污染之一[1]。隨著鉛的廣泛應(yīng)用，鉛污染的暴露風(fēng)險(xiǎn)無處不在，如含鉛塑料制品作為食品接觸材料、可再生資源中殘留的鉛等。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)成人血鉛水平高于發(fā)達(dá)國(guó)家，兒童血鉛水平更是達(dá)到了70 μg/L左右，要比發(fā)達(dá)國(guó)家高出2～3倍[2]。自2000年我們?nèi)娼逛N售含鉛汽油，空氣中的鉛污染得到了巨大改善。但隨著我國(guó)汽車保有量的快速增長(zhǎng)，汽車尾氣中的鉛細(xì)顆粒物污染形成的低濃度、長(zhǎng)時(shí)間暴露危險(xiǎn)不容忽視。鉛在顆粒物狀態(tài)更容易穿透生物體內(nèi)的細(xì)胞膜進(jìn)入體內(nèi)，并且在體內(nèi)產(chǎn)生累積毒性效應(yīng)[3-7]。研究發(fā)現(xiàn)低濃度鉛暴露會(huì)隨著暴露時(shí)間的增加，導(dǎo)致越來越高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生率、孕產(chǎn)婦流產(chǎn)和發(fā)育畸形等問題[8-9]，甚至造成嬰幼兒智力、記憶力、神經(jīng)行為的障礙[10]。但目前低濃度、長(zhǎng)期含鉛細(xì)顆粒物吸入暴露后，在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)運(yùn)及體內(nèi)分布并沒有相關(guān)報(bào)道。因此，本文以含鉛細(xì)顆粒物為研究對(duì)象，模擬長(zhǎng)期、低濃度暴露，研究其在大鼠體內(nèi)的吸收、分布與代謝，為含鉛細(xì)顆粒物的毒性研究提供數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AA-6800原子吸收光譜儀(日本島津公司)；HOPE-MED 8050 動(dòng)式染毒控制系統(tǒng)(天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司)；SFC-3BT呼吸粉塵采樣器(常州德杜精密儀器有限公司)；大氣顆粒物PM2.5采樣器(TAS)(培德國(guó)際有限公司)；JY2500汽油發(fā)動(dòng)機(jī)(福建省佳友機(jī)電)；馬爾文粒度儀(Zetasizer Nano ZS 90)；汽油為中國(guó)石化92#汽油；硝酸鉛購自西隴化工股份有限公司。

1.2 模擬環(huán)境的建立

如圖1所示，將汽油發(fā)動(dòng)機(jī)尾氣接入動(dòng)靜式染毒柜中：汽油發(fā)動(dòng)機(jī)發(fā)動(dòng)引擎后(轉(zhuǎn)速3 600 r/min)，排放的尾氣經(jīng)排氣軟管直接接入染毒柜，通過補(bǔ)充清潔空氣來控制染毒柜中PM2.5的濃度，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置染毒柜中進(jìn)行染毒。利用大氣顆粒物PM2.5采樣器采集模擬環(huán)境中的細(xì)顆粒物，隨后消化，并利用原子吸收光譜儀測(cè)定鉛濃度、利用馬爾文粒度儀進(jìn)行粒徑分析。

圖1 模擬環(huán)境系統(tǒng)示意圖Figure 1 Schematic of simulation environment.

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

雄性SD大鼠30只，體重(180±20) g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、經(jīng)口染毒組(灌胃)、吸入染毒組。每組10只大鼠。對(duì)照組采用生理鹽水灌胃。經(jīng)口染毒組以硝酸鉛為鉛來源。吸入染毒組以模擬環(huán)境進(jìn)行染毒，每天10 h，連續(xù)染毒28 d。

1.4 樣本的收集

染毒后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于代謝籠中，12 h開始第一次收集尿液和糞便，之后于1、2、3、7、10、14、21、28 d收集尿液和糞便；染毒后72 h開始第一次眼眶取血，之后于7、10、14、21、28 d采集血樣，檢測(cè)血鉛含量變化。

1.5 樣品處理

按照姚朝英等[11]報(bào)道的方法，將血液、尿液、糞便或者烘干的臟器組織放入燒杯中，按1 g組織或1 mL 液體加入混合酸(硝酸∶高氯酸=5∶1)，室溫過夜消化，直至乳液澄清。次日，將燒杯置于電熱板上加熱煮沸，直到白煙冒盡，消解完全后即得白色殘?jiān)?。用去離子水分3次沖洗燒杯內(nèi)的白色殘?jiān)?，利?0 mL試管定容沖洗液，搖勻，待測(cè)，同時(shí)做平行空白。

1.6 鉛濃度測(cè)定

采用原子吸收光譜法測(cè)定鉛的濃度，儀器工作參數(shù)為波長(zhǎng)283.3 nm，狹縫0.7 nm，燈電流10 mA，積分時(shí)間5 s，乙炔流量1.2 L/min，空氣流量7.5 L/min，燃燒器高度6 mm，氘燈背景校正。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建的模擬環(huán)境含鉛細(xì)顆粒物情況

所有的SD大鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中，對(duì)該屏障系統(tǒng)空氣質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如圖2所示，清潔空氣粒子細(xì)顆粒物濃度為(7.69±3.21) mg/m3，鉛濃度為(0.12±0.03) μg/m3；粒徑范圍為(90.39±45.01) nm。構(gòu)建的低濃度鉛污染環(huán)境中，PM2.5濃度高達(dá)(515.16±8.79) mg/m3，鉛濃度為(7.05±0.83) μg/m3，粒徑范圍為(271.20±148.70) nm。

圖2 清潔空氣和發(fā)動(dòng)機(jī)尾氣構(gòu)建的低濃度鉛污染環(huán)境指標(biāo)比較。(A)細(xì)顆粒物濃度，(B)鉛濃度，(C)清潔空氣，(D)低濃度鉛污染環(huán)境粒徑分布Figure 2 The environmental indicators of the clean air and the microenvironment of low concentration lead.(A)The concentration of PM2.5，(B)The concentration of Pb，(C)Clean air，(D)The particle size distribution low concentration of lead.

2.2 各組給藥濃度

對(duì)構(gòu)建的模擬環(huán)境中細(xì)顆粒物中的鉛濃度進(jìn)行檢測(cè)。按照大鼠氣體呼吸量為(50～101 mL/min)，由此估計(jì)汽車尾氣組每天染毒10 h，吸入的鉛含量約為(0.21～0.42) μg/d。因此，陽性對(duì)照組(經(jīng)口染毒組)為了達(dá)到相同的鉛攝入量，以硝酸鉛為替代，進(jìn)行灌胃，濃度采用0.42 μg/d，連續(xù)28 d。

吸入染毒組按照鉛濃度為(0.12±0.03) μg/m3染毒，每天10 h，連續(xù)28 d。

2.3 血鉛、鉛代謝及體重變化

鉛進(jìn)入體內(nèi)后將進(jìn)入血液循環(huán)。見圖3A，吸入染毒組和經(jīng)口染毒組的血鉛濃度隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)而逐步上升，直到染毒結(jié)束28 d達(dá)到峰值。比較經(jīng)口染毒組和吸入染毒組的血鉛變化，可以看出，經(jīng)口染毒組鉛入血速度更快。但染毒在28 d結(jié)束后，繼續(xù)觀察血鉛的變化，可以發(fā)現(xiàn)：經(jīng)口染毒組的血鉛濃度迅速下降。這可能是由于染毒結(jié)束后，不再有鉛從腸道吸收入血。但血鉛中濃度依然比對(duì)照組高，這主要是由于轉(zhuǎn)移到骨、臟器等內(nèi)的鉛向血液中釋放。而吸入染毒組的血鉛從28 d后明顯要高于經(jīng)口染毒組，這與前期染毒過程中在肺內(nèi)蓄積了大量的鉛后，逐步向血液釋放導(dǎo)致，這一點(diǎn)可以從對(duì)各組肺內(nèi)的鉛濃度進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果得到驗(yàn)證。

重金屬的代謝主要是通過糞便及尿液。圖3B是各組56 d內(nèi)大鼠糞鉛含量的變化。經(jīng)口染毒組糞鉛含量從染毒第1周開始到染毒結(jié)束(4周)，糞鉛含量達(dá)到3.0 μg/g以上，遠(yuǎn)高于吸入染毒組的1.56～2.13 μg/g，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。而染毒結(jié)束后，糞鉛濃度迅速下降。圖3C是56 d內(nèi)尿鉛的變化，吸入染毒組的尿鉛濃度迅速上升，直到染毒結(jié)束。經(jīng)口染毒組尿鉛雖有上升，但要小于吸入染毒組。并且同糞鉛濃度曲線相似，染毒結(jié)束(28 d)后，尿鉛濃度迅速下降。結(jié)合圖3B、3C的結(jié)果，可以看出經(jīng)口途徑、吸入途徑染毒均主要是通過糞便排泄，另外尿液排泄是吸入染毒后排泄的另一條主要途徑。

三組大鼠的平均體重結(jié)果如圖3D所示。56 d內(nèi)陰性對(duì)照組體重迅速增加，吸入染毒組和經(jīng)口染毒組體重增加緩慢。與對(duì)照組相比，不論是經(jīng)口染毒組還是吸入染毒組，與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

圖3 染毒后血鉛、糞鉛、尿鉛濃度和體重變化。1～28 d為染毒期(28 d)，29～56 d為觀察期。(A)血鉛濃度變化；(B)糞鉛濃度變化；(C)尿鉛濃度變化；(D)體重變化曲線。(吸入染毒組與經(jīng)口染毒組比較，**P<0.01)Figure 3 The curve of Pb concentration in the blood，feces，urinary and the change of body weight.The rats were exposed to PM2.5 for 28 d and following 28 d observation period.The curve of (A) Blood lead，(B) Fecal lead，(C) Urinary lead，(D) The change of body weight.(**P<0.01，significant compared with oral administration group).

2.4 鉛的體內(nèi)分布

由染毒后血鉛、鉛代謝及體重變化，推測(cè)吸入染毒組鉛在體內(nèi)蓄積量大。由此我們對(duì)染毒期內(nèi)肺部鉛濃度變化進(jìn)行檢測(cè)。如圖4A所示，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，吸入染毒組肺內(nèi)鉛明顯高于其他組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。說明大量的鉛細(xì)顆粒物能夠在肺內(nèi)沉積。56 d后，各組鉛在各臟器的分布，如圖4B所示。經(jīng)口染毒組和吸入染毒組各臟器鉛含量均有所增加，且肺、腎、脾及心內(nèi)鉛含量增加，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。染毒后經(jīng)過28 d，吸入染毒組的肺鉛仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于經(jīng)口染毒組肺鉛含量(P<0.01)。圖4B顯示了各組骨鉛含量的變化，吸入染毒組股骨、尾骨、肋骨鉛含量均高于對(duì)照組及經(jīng)口染毒組，有統(tǒng)計(jì)差異(P<0.01)。鉛在骨骼組織分布順序?yàn)椋豪吖?股骨>尾骨。

結(jié)合圖3、4的結(jié)果，可以看出吸入染毒組在體內(nèi)的蓄積量比較大，因此對(duì)殘留鉛的比例進(jìn)行計(jì)算，如圖4D，經(jīng)過28 d的染毒，28 d正常飼養(yǎng)后，經(jīng)口染毒組鉛的殘留量是18.98%±4.56%，而吸入染毒組鉛的殘留量高達(dá)33.71%±7.38%，遠(yuǎn)高于經(jīng)口染毒組(P<0.01)。

圖4 鉛的體內(nèi)分布。(A)染毒期內(nèi)肺鉛濃度變化；(B)56 d后各組重要臟器鉛含量；(C)56 d后骨鉛濃度；(D)吸入染毒組與經(jīng)口染毒組鉛殘留量比較，**P<0.01Figure 4 In vivo distribution of Pb.(A) The change of Pb concentration in lunge during inhalation exposure.(B) The concentrations of Pb in major organs in each group after 56 d.(C) the bone level of lead after 56 d.(D) The residue of Pb in the oral exposure group，and the inhalation group，**P<0.01.

3 討論

重金屬鉛的暴露呈現(xiàn)細(xì)顆粒化及低濃度化，雖然目前規(guī)定的血鉛閾值水平為0.1 mg/mL[12]，但有證據(jù)表明鉛的安全閾值無法確定。因此必須考慮任何鉛暴露風(fēng)險(xiǎn)因素，特別是不同暴露途徑與時(shí)間[13-14]。暴露途徑的不同，意味著金屬在體內(nèi)的吸收和組織分布不同，對(duì)機(jī)體的危害不同。本實(shí)驗(yàn)比較了不同暴露途徑(亞急性經(jīng)口和吸入毒性實(shí)驗(yàn))對(duì)大鼠進(jìn)行鉛染毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在吸入染毒和經(jīng)口染毒組體重均增加緩慢，且吸入染毒組體重明顯下降，可能與吸入染毒后，大量鉛在肺內(nèi)蓄積，并不斷向血液、臟器等轉(zhuǎn)移，從而使得大鼠處在高鉛污染狀態(tài)，影響了大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。

在低濃度下持續(xù)暴露于鉛導(dǎo)致其在體內(nèi)積聚，并分布于各個(gè)器官如：肝臟、腎臟、肺臟、胰腺、脾臟，最終累積在骨骼中[15]。鉛暴露人群的尸體解剖研究也表明，在軟組織中，肝臟是儲(chǔ)存最多的器官(33%)，其次是腎臟。對(duì)兒童血鉛進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，鉛在骨骼、腎臟和肺臟中含量較高[16]。也有人用同位素實(shí)驗(yàn)證明了鉛在大鼠體內(nèi)的分布，主要在肝和腎臟中，睪丸、心臟、腦中的鉛含量較低，但并未對(duì)骨骼鉛分布情況進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)研究了不同暴露途徑(亞急性經(jīng)口和吸入毒性實(shí)驗(yàn))染毒后大鼠體內(nèi)血鉛、糞鉛、尿鉛、臟器鉛、骨鉛含量的變化，在大鼠所有器官和組織中都有發(fā)現(xiàn)鉛的分布。其中吸入染毒后，大量的鉛以細(xì)顆粒物的形式進(jìn)入體內(nèi)，在肺內(nèi)大量蓄積。

鉛的代謝主要通過腎過濾和尿糞排泄，少量鉛也排泄在汗液，頭發(fā)和指甲，剩余分布到軟組織和骨。本研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)口染毒組中81.02%的鉛可以通過尿糞排泄掉，剩余部分才緩慢入血；而吸入染毒組的鉛可以通過尿液排泄，尿糞總排泄率約為66.29%，導(dǎo)致大量在肺內(nèi)沉積，進(jìn)而加重了骨沉積。

4 結(jié)論

針對(duì)食品接觸性塑料制品、可再生資源、汽車尾氣等低濃度鉛暴露，開展了大鼠低濃度含鉛細(xì)顆粒物暴露體內(nèi)生物轉(zhuǎn)運(yùn)研究。通過對(duì)比吸入染毒及經(jīng)口染毒后體內(nèi)分布、排泄，得出含鉛細(xì)顆粒物吸入更容易在體內(nèi)(肺)蓄積，具有入血速度快、肺內(nèi)沉積量大的特點(diǎn)。最終主要在股骨和肋骨內(nèi)蓄積，且排泄慢，體內(nèi)鉛殘留含量更高，危害更大。因此，低濃度、長(zhǎng)時(shí)間含鉛細(xì)顆粒物的環(huán)境暴露對(duì)人體的危害需引起人們重視。