lncRNA HOXC-AS3吸附miR-216a-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制研究①

陳吉柏 范長玲 張 浩（海南省儋州市人民醫(yī)院胸心腫瘤外科，儋州571799）

肺癌是世界第一大癌癥，在惡性腫瘤中致死率最高，且患者數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者占患者總數(shù)的85%左右，5年生存率低于15%［1-2］。手術(shù)和靶向治療是肺癌個(gè)性化治療的主要手段，研究肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是肺癌基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤中通常表達(dá)失調(diào)，參與肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌及血液系統(tǒng)惡性腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥等過程［3］。多種lncRNA在肺癌中差異表達(dá)，參與癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等多種生理過程［4］。HOXC-AS3是一種位于染色體7p13區(qū)域的lncRNA，在胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)［5-7］。lncRNA HOXC-AS3在肺癌中表達(dá)和作用尚未明確。本研究通過starBase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-216a-5p可能是lncRNA HOXC-AS3的靶點(diǎn)，miR-216a-5p在小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）中表達(dá)下調(diào)，與SCLC惡性進(jìn)展和化學(xué)耐藥相關(guān)［8-9］。lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在肺癌中的關(guān)系尚未明確。本研究檢測(cè)兩者在肺癌組織和細(xì)胞系中的含量，假設(shè)lncRNA HOXC-AS3可靶向miR-216a-5p調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，以期為肺癌治療提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月至2018年6月于本院病理檢查確診為NSCLC的患者手術(shù)切除的肺癌組織及癌旁組織（距離肺癌組織邊緣＞1.5 cm）各45例，男性30例，女性15例，年齡23～76歲，平均年齡（51.20±16.22）歲，鱗癌28例，腺癌15例，其他2例。NSCLC分級(jí)：Ⅰ級(jí)5例，Ⅱ級(jí)12例，Ⅲ級(jí)19例，Ⅳ級(jí)20例。NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《非小細(xì)胞肺癌臨床指南》，所有患者術(shù)前未接受放化療治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.1.2 細(xì)胞、主要試劑與儀器 人肺癌細(xì)胞系H1299、A549、GLC-12和人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B（ATCC）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司）；Transwell板（美國Corning公司）；細(xì)胞增殖抗原Ki-67、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（美國Santa cruz公司）；引物、lncRNA HOXCAS3小干擾RNA（si-HOXC-AS3）及其陰性對(duì)照、ln?cRNA HOXC-AS3過表達(dá)載體（pcDNA-HOXC-AS3）及對(duì)照空載體（overexpression control）、miR-216a-5p模擬物（mimics）及陰性對(duì)照序列（miR-con）、miR-216a-5p抑制劑（anti-miR-216a-5p）及抑制劑陰性對(duì)照序列（anti-miR-con）、lncRNA HOXC-AS3野生型（WT-HOXC-AS3）和突變型（MUT-HOXC-AS3）報(bào)告載體（上海吉瑪制藥有限公司）；雙熒光載體雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒（美國Promega公司）；Lipo?fectamine 2000、RNA提取試劑Trizol、Real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT-PCR）（美國Invitrogen公司）；CCK-8試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（上海碧云天）；Real-time PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H1299、A549、GLC-12和BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、濕度97%，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p表達(dá) Trizol試劑提取總RNA，微量核算儀檢測(cè)RNA純度和濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)。引 物 序列：lncRNA HOXC-AS3 F：5′-CACCTCTCTCATCGAAAAACCG-3'，R：5'-GCACCAGGAAAGAGGACAATTC-3'；β-actin F：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，R：5'-GCTGCTACCTTCACCGTTCC-3'；miR-216a-5p F：5'-TAATCTCAGCTGGCAACT-3'，R：5'-GGTGTC?GTGGAGTCG-3'；U6 F：5'-TGCGGGTGCTCGCTTCG?GCAGCA-3'，R：5'-CCACTGCAGGGTCCGAGGT-3'。lncRNA HOXC-AS3以β-actin為內(nèi)參，miR-216a-5p以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞調(diào)整為1×104個(gè)/ml，2.5 ml/孔接種于6孔板，當(dāng)生長至60%融合時(shí)，更換不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基。根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書將Silence control、si-HOXC-AS3、overex?pression control、pcDNA-HOXC-AS3、si-HOXC-AS3與anti-miR-con、si-HOXC-AS3與anti-miR-216a-5p分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，依次記為si-con組、si-HOXC-AS3組、pcDNA組、pcDNA-HOXC-AS3組、si-HOXC-AS3+anti-miR-con組、si-HOXC-AS3+anti-miR-216a-5p組。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞調(diào)整為1×104個(gè)/ml，200μl/孔接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后，20μl/孔 加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度（A），細(xì)胞存活率（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.2.5 Western blot檢測(cè)增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞調(diào)整為1×104個(gè)/ml，1.0 ml/孔接種于24孔板，培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液冰上孵育20 min，充分裂解后，4℃、12 000 r/min離心10 min，-80℃保存?zhèn)溆谩CA法測(cè)定上清中蛋白含量，取適量蛋白溶液，加入1×上樣緩沖液，混合均勻，100℃煮沸5 min，蛋白變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入Ki-67（1：1 000）、Cyclin D1（1：1 000）、MMP-2（1：2 000）、MMP-9（1：2 000）、N-cadherin（1：1 000）、Vi?mentin（1：1 000）、E-cadherin（1：1 000）和β-actin（1：5 000）一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，5 min/次。加入辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（1：1 000），室溫孵育2 h，加入ELC化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平以其蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞用不含血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2×105個(gè)/ml，Transwell小室置于24孔板，下室加入500μl含10%FBS培養(yǎng)基，上室加入100μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，取出小室，棉簽擦去基質(zhì)膠和上層小室細(xì)胞，4%甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡觀察。隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將-20℃取出的Matrigel液化后用4℃無血清培養(yǎng)基以1：8比例稀釋，取50μl加入Transwell小室上室，自然晾干，加入100μl細(xì)胞懸液，下室加入500μl含10%FBS的培養(yǎng)基，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 用marker筆在6孔板背后均勻劃5條直線，橫穿過孔，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml，2.5 ml/孔接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，200μl無菌槍頭尖端在各孔相同位置劃線，PBS沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞，每孔加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，拍照，計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示lncRNA HOXC-AS3與miR-216a-5p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增含miR-216a-5p結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA HOXC-AS3序列，構(gòu)建lncRNA HOXC-AS3的野生型（WT-HOXC-AS3）載體。采用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變后，構(gòu)建lncRNA HOXC-AS3突變型（MUT-HOXC-AS3）載體。分別將WT-HOXC-AS3、MUT-HOXC-AS3與miR-con或miR-216a-5p共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，裂解，離心收集上清，-20℃保存或直接檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，總體差異采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNAHOXC-AS3和miR-216a-5p在肺癌組織和A549、A549、GLC-12細(xì)胞系中的表達(dá) 與癌旁組織（45例）相比，肺癌組織組中l(wèi)ncRNA HOXC-AS3水平顯著上升，miR-216a-5p水平顯著下降（P＜0.05）；與人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B組相比，肺癌細(xì)胞H1299、A549和GLC-12組中miR-216a-5p水平下降，lncRNA HOXC-AS3水平顯著上升（P＜0.05，表1、2）。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選擇水平差異較大的A549細(xì)胞進(jìn)行。

2.2 沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 與si-con組相比，si-HOXCAS3組A549細(xì)胞lncRNA HOXC-AS3表達(dá)和細(xì)胞活性顯著降低，增殖蛋白Ki-67和Cyclin D1表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3的pcD?NA-HOXC-AS3組則結(jié)果相反，見圖1、表3。

表1 lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（±s，n=45）Tab.1 Expressions of lncRNA HOXC-AS3 and miR-216a-5p in lung cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=45）

表1 lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（±s，n=45）Tab.1 Expressions of lncRNA HOXC-AS3 and miR-216a-5p in lung cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=45）

Note：Compared with adjacent tissuesgroup，1）P＜0.05.

Groups Adjacent tissues Lung cancer tissue t P lncRNA HOXCAS3/β-actin 0.94±0.27 3.28±0.671）21.383 0.000 miR-216a-5p/U6 1.03±0.19 0.66±0.131）10.781 0.000

2.3 沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移的影響 與si-con組相比，si-lncRNA HOXC-AS3組MMP-2和MMP-9含量、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著下降，細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3的pcDNA-HOXCAS3組則結(jié)果相反（圖2、表4）。

表2 lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在正常肺上皮細(xì)胞株和肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)（±s，n=9）Tab.2 Expressions of lncRNA HOXC-AS3 and miR-216a-5p in normal lung epithelial cell lines and lung can?cer cell lines（±s，n=9）

表2 lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在正常肺上皮細(xì)胞株和肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)（±s，n=9）Tab.2 Expressions of lncRNA HOXC-AS3 and miR-216a-5p in normal lung epithelial cell lines and lung can?cer cell lines（±s，n=9）

Note：Compared with the BEAS-2Bgroup，1）P＜0.05.

Groups BEAS-2B H1299 A549 GLC-12 F P lncRNA HOXCAS3/β-actin 1.02±0.23 4.15±0.591）5.25±0.421）3.81±0.641）118.155 0.000 miR-216a-5p/U6 1.04±0.12 0.42±0.081）0.36±0.111）0.55±0.091）83.671 0.000

圖1 Western blot檢測(cè)沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖蛋白Cyclin D1和Ki-67表達(dá)的影響Fig.1 Effects of silenced or overexpressed lncRNA HOXC-AS3 on expressions of proliferation proteins Cyclin D1 and Ki-67 in lung cancer A549 cells de?tected by Western blot

表3 沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.3 Effectsof silenced or overexpressed lncRNAHOXCAS3 on proliferation of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

表3 沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響（±s，n=9）Tab.3 Effectsof silenced or overexpressed lncRNAHOXCAS3 on proliferation of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with silence control group，1）P＜0.05；compared with overexpression control group，2）P＜0.05.

Groups NC silence control si-HOXC-AS3 overexpression control pcDNA-HOXC-AS3 F P lncRNA HOXCAS3/β-actin 0.98±0.13 1.02±0.12 0.23±0.051）0.98±0.11 5.06±0.642）368.968 0.000 Cell viability（%）99.14±7.72 94.69±9.16 68.67±5.341）95.86±9.37 162.74±7.612）172.609 0.000

圖2 Western blot檢測(cè)沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌A549細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響Fig.2 Effects of silenced or overexpressed lncRNA HOXC-AS3 on expressions of proliferation pro?teins MMP-2 and MMP-9 in lung cancer A549 cells detected by Western blot

表4 沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of silenced or overexpressed lncRNA HOXC-AS3 on migration and invasion of lung can?cer A549 cells（±s，n=9）

表4 沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.4 Effects of silenced or overexpressed lncRNA HOXC-AS3 on migration and invasion of lung can?cer A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with silence control group，1）P＜0.05；compared with overexpression control group，2）P＜0.05.

Groups NC silence control si-HOXC-AS3 overexpression control pcDNA-HOXC-AS3 F P Cell migration number 183.86±10.25 174.54±14.35 103.30±7.251）181.56±13.36 264.67±18.312）167.815 0.000 Cell invasion number 78.85±7.41 84.49±9.48 47.30±7.801）82.32±9.67 147.55±7.762）166.896 0.000 Cell scratch heal?ing rate（%）88.34±4.42 86.35±4.64 74.87±3.131）84.35±4.34 95.64±5.672）24.614 0.000

圖3 Western blot檢測(cè)肺癌細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimen?tin proteins in lung cancer A549 cells detected by Western blot

2.4 沉默或過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3對(duì)肺癌A549細(xì)胞EMT的影響 如圖3所示，與si-con組相比，si-lncRNA HOXC-AS3組A549細(xì)胞N-cadherin和Vimentin蛋白含量降低，E-cadherin蛋白含量升高（P＜0.05）；過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3的pcDNAHOXC-AS3組則結(jié)果相反。

2.5 lncRNA HOXC-AS3靶向作用于miR-216a-5p 如圖4所示，starBase預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA HOXC-AS3序列中存在與miR-216a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與miRcon組相比，miR-216a-5p組野生型WT-HOXC-AS3的熒光素酶相對(duì)活性顯著下降（P＜0.05）；而突變型MUT-HOXC-AS3的熒光素酶相對(duì)活性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。qRT-PCR結(jié)果顯示，沉默HOXC-AS3可上調(diào)miR-216a-5p含量，過表達(dá)HOXC-AS3可下調(diào)miR-216a-5p含量（P＜0.05，表6）。

2.6 干擾miR-216a-5p部分逆轉(zhuǎn)沉默HOXC-AS3對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用 如圖5、表7所示，與si-HOXC-AS3+anti-miR-con組相比，si-HOXC-AS3+anti-miR-216a-5p組miR-216a-5p水平顯著下降，A549細(xì)胞活性和細(xì)胞劃痕愈合率升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增多，Ki-67、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin水平升高，E-cadherin水平降低（P＜0.05）。

圖4 lncRNA HOXC-AS3與miR-216a-5p的靶向結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 Binding sites of lncRNA HOXC-AS3 targeting with miR-216a-5p

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Tab.5 Dual luciferase reporter assay（±s，n=9）

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Tab.5 Dual luciferase reporter assay（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05.

Groups miR-con miR-216a-5p t P WT-HOXC-AS3 0.99±0.10 0.59±0.071）9.831 0.000 MUT-HOXC-AS3 1.14±0.16 1.22±0.15 1.094 0.290

表6 沉默和過表達(dá)HOXC-AS3對(duì)miR-216a-5p表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.6 Effects of silence and overexpression of lncRNA HOXC-AS3 on expression levels of miR-216a-5p（±s，n=9）

表6 沉默和過表達(dá)HOXC-AS3對(duì)miR-216a-5p表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.6 Effects of silence and overexpression of lncRNA HOXC-AS3 on expression levels of miR-216a-5p（±s，n=9）

Note：Compared with silence control group，1）P＜0.05；compared with overexpression control group，2）P＜0.05.

Groups silence control si-HOXC-AS3 overexpression control pcDNA-HOXC-AS3 F P miR-216a-5p/U6 0.98±0.13 4.27±0.351）1.03±0.09 0.35±0.052）750.998 0.000

圖5 Western blot檢測(cè)肺癌細(xì)胞Ki-67、Cyclin D1、MPP-2、MPP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of Ki-67，Cyclin D1，MPP-2，MPP-9，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin proteins in lung cancer A549 cells detected by Western blot

表7 沉默HOXC-AS3和過表達(dá)miR-216a-5p對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.7 Effects of silencing HOXC-AS3 and overexpressing miR-216a-5p on proliferation，migration and invasion of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

表7 沉默HOXC-AS3和過表達(dá)miR-216a-5p對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Tab.7 Effects of silencing HOXC-AS3 and overexpressing miR-216a-5p on proliferation，migration and invasion of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-HOXC-AS3+anti-miR-con group，1）P＜0.05.

Groups si-HOXC-AS3+anti-miR-con si-HOXC-AS3+anti-miR-216a-5p F P miR-216a-5p/U6 1.03±0.14 0.69±0.081）6.326 0.000 Cell viability（%）101.45±8.67 153.28±12.371）10.293 0.000 Cell migration number 128.68±11.26 163.63±13.341）6.006 0.000 Cell invasion number 46.47±5.39 71.66±6.821）8.693 0.000 Cell scratch healingrate（%）73.73±4.96 82.87±5.641）3.651 0.002

3 討論

研究表明，lncRNA通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平基因表達(dá)和功能發(fā)揮多種生物學(xué)功能，廣泛參與癌癥、代謝紊亂和心血管疾病等疾病發(fā)病過程。lncRNA HOXC-AS3是一種最近新發(fā)現(xiàn)的ln?cRNA，位于染色體12q13.13區(qū)域，是HOXC10的反義轉(zhuǎn)錄本，HOX基因?qū)π螒B(tài)發(fā)生和發(fā)育至關(guān)重要［10-11］。BHATLEKAR等［12］研究發(fā)現(xiàn)，HOXC家族基因表達(dá)在多數(shù)實(shí)體腫瘤中上調(diào)，HOXA9和HOXB13最常發(fā)生失調(diào)，HOXA常在乳腺癌和卵巢癌中異常表達(dá)，HOXB在結(jié)腸癌中異常表達(dá)，HOXC基因在前列腺癌和肺癌中表達(dá)失調(diào)，HOXD基因在結(jié)腸癌和乳腺癌中表達(dá)失調(diào)。HOX基因lncRNA的產(chǎn)生可能在腫瘤發(fā)生中起重要作用。胃癌中l(wèi)n?cRNA HOXC-AS3通過與YBX1結(jié)合介導(dǎo)胃癌發(fā)生［5］。lncRNA HOXC-AS3可促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖、遷移和侵襲，靶向結(jié)合miR-3922-5p促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移［6-7］。lncRNA HOXC-AS3在肺癌中的表達(dá)尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXC-AS3在肺癌組織和肺癌H1299、A549和GLC-12細(xì)胞中表達(dá)上升，而沉默lncRNA HOXC-AS3表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3則結(jié)果相反，提示lncRNA HOXC-AS3在肺癌發(fā)展中具有重要作用。

本研究通過starBase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXCAS3與miR-216a-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-216a-5p在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中表達(dá)下調(diào)，靶向TCTN1可抑制ESCC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［13］。miR-216a-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下降，上調(diào)其表達(dá)可靶向p21激活蛋白激酶2（PAK2）抑制癌細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移［14］。研究表明，miR-216a-5p在SCLC中表達(dá)下調(diào)，miR-216a-5p通過Bcl-2家族蛋白調(diào)控SCLC細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞周期［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a-5p在肺癌組織和肺癌H1299、A549和GLC-12細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與上述研究既往研究結(jié)論一致。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果表明，lncRNA HOXC-AS3可靶向負(fù)調(diào)控miR-216a-5p表達(dá)，干擾miR-216a-5p可部分逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA HOXC-AS3對(duì)A549細(xì)胞惡性行為的抑制作用，證實(shí)肺癌A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p存在調(diào)控關(guān)系。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞癌變，針對(duì)肺癌表皮生長因子受體（EGFR）的靶向治療即是通過抑制EMT實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌的抑制作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默ln?cRNA HOXC-AS3可抑制A549細(xì)胞EMT，而過表達(dá)lncRNA HOXC-AS3和干擾miR-216a-5p則逆轉(zhuǎn)這一作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織和肺癌H1299、A549和GLC-12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOXC-AS3表達(dá)上調(diào)，miR-216a-5p表達(dá)下調(diào)，肺癌A549細(xì)胞中l(wèi)n?cRNA HOXC-AS3可靶向miR-216a-5p調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT，lncRNA HOXC-AS3可能是NSCLC的分子靶點(diǎn)。