microRNA-29a通過PI3K/AKT/mTOR信號途徑抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生①

王彩霞 夏 敏 王 潔 喬世聰 萬 丹 姚 瑤（重慶市中醫(yī)院婦科，重慶400021）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，約占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的1/3［1］。近年來，隨著人們生活方式及飲食結(jié)構的改變，EC的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，且發(fā)病年齡日趨年輕化，有研究報道5%至10%的EC患者年齡在45歲或以下［2］。而臨床治療方面，早期診斷的EC患者可進行單獨手術治療和（或）輔助化療或放療的聯(lián)合治療［3］；而中晚期EC患者的治療方法包括根治性子宮切除術、雙側(cè)輸卵管卵巢切除術、腹腔淋巴結(jié)消掃術，并根據(jù)疾病的分級及分期再進行化療或放療［4］。故EC嚴重威脅女性的生殖及生命健康。但迄今為止EC的發(fā)病原因尚未完全闡明，因此積極深入地從基因、分子層面探索其病因及發(fā)病機制對尋找及研發(fā)有效治療EC的靶向藥物具有重要意義。microRNA（miRNA）是一類由19～25個核苷酸組成的短鏈非編碼小RNA分子，可通過與目的基因的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）進行配對結(jié)合，并對后者的mRNA進行降解或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學行為，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用［5-6］。近年來，有研究表明microRNA與EC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程密切相關［7-8］。miR-29a位于染色體7q32.3上，是mi-29家族最新發(fā)現(xiàn)的成員之一。有學者報道在黑色素瘤中，miR-29a能通過NF-κB及Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控BMI1基因的表達從而抑制黑色瘤細胞的生長、遷移及侵襲功能，從而發(fā)揮抑癌基因的作用［9］。在前列腺癌中，閻成全等［10］應用基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-29a在腫瘤組織中的表達顯著降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-29a可能通過抑制前列腺癌細胞中賴氨酸特異性去甲基化酶4B（KDM4B）的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長并誘導其發(fā)生凋亡。但miR-29a在EC中的報道還十分罕見，有待進一步探究。本研究分別從基因芯片，生物信息學及細胞生物學技術方面探索miR-29a在EC發(fā)生發(fā)展中的生物學功能及相關機制，從而為尋求新的子宮內(nèi)膜癌的靶向治療藥物提供實驗室基礎及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本 選取2018年4月至2019年4月于重慶市中醫(yī)院住院接受手術治療，且術后病理確診為EC的15例患者（EC組），其平均年齡（53.3±2.7）歲。對照組為同期在我院住院因子宮肌瘤切除子宮，經(jīng)病理證實為正常子宮內(nèi)膜的15例患者（normal組），其平均年齡（54.1±6.9）歲。兩組患者的年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。用于提取RNA的子宮內(nèi)膜組織在離體后迅速置于液氮中保存。所有受試對象術前均未接受任何放療、化療及激素治療且無內(nèi)分泌、免疫、代謝性等疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，患者及家屬知情同意并簽署相關知情同意書。

1.1.2 細胞系及試劑 子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1A細胞購于中國科學院上海細胞庫；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12、Opti-MEM購自Gibco公司；Trizol、Lipofectamine2000、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄與實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒、基質(zhì)膠購自BD公司；MTT試劑盒、青鏈霉素混合液（均為100 U/ml）購自Sigma公司；miR-29a mimic、miR-29a inhibitor及對應的陰性對照隨機序列（mimic-scramble及inhibitor-scramble）、PI3K野生型（WT）及突變型（MUT）熒光素酶報告基因質(zhì)粒購自上海吉瑪；熒光酶檢測試劑盒購自Promega公司；Transwell小室（孔徑8μm）購自Millipore公司；PI3K、p-AKT、mTOR抗體、GAPDH購自Abcam公司；實時熒光定量PCR引物購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片技術篩選差異表達miRNA 參考相關文獻［11］選取3對EC組與對照組內(nèi)膜組織中的RNA，委托北京博奧生物公司進行檢測以篩選差異表達miRNA，簡述如下：按照miRNeasy Mini Kit試劑盒使用說明從3對受試者的內(nèi)膜組織中提取等量的總RNA進行純化。分光光度計檢測RNA純度與濃度后，每個樣本取1μg的RNA并按照Hy3/Hy5 Power Labeling Kit說明對RNA樣本進行標記。將上述標記后的RNA與miRCURYTMLNA Array進行雜交，再采用GenePix 4000B芯片掃描儀讀取芯片的原始信號強度。然后通過芯數(shù)據(jù)的標準化校正后，統(tǒng)計學顯著性檢驗與聚類分析篩選獲得在EC內(nèi)膜組織樣品與正常對照組樣品中具有顯著差異表達的miRNA譜，并以熱圖的形式展出。其中篩選標準為表達上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0的miRNA分子。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 HEC-1A細胞常規(guī)復蘇后用含有10%FBS與1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，待細胞生長融合至70%～80%時用0.25%的胰酶進行消化，室溫下800 r/min離心5 min，棄上清，DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后進行傳代。轉(zhuǎn)染前一天，將處于對數(shù)生長期的HEC-1A細胞常規(guī)消化后接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞密度至2×105個/孔，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。參考文獻［12］進行脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染，簡述如下：將DMEM/F12培養(yǎng)基更換為Opti-MEM培養(yǎng)液，并根據(jù)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書分別將miR-29a mimic、in?hibitor、mimic-scramble和inhibitor-scramble，按終濃度50 nmol/L轉(zhuǎn)染入HEC-1A細胞內(nèi)。并將細胞分為：miR-29a過表達組，即轉(zhuǎn)染miR-29a mimic組；mimic-scramble組，即轉(zhuǎn)染miR-29a mimic陰性對照隨機序列；miR-29a抑制組，即miR-29a inhibitor組；inhibitor-scramble組，即轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor陰性對照隨機序列；正常對照組即為無任何處理的HEC-1A細胞。于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換為含10%FBS的DMEM/F12常規(guī)培養(yǎng)液。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細胞用于后續(xù)實驗研究。

1.2.3 MTT細胞增殖實驗 參考文獻［13］進行MTT細胞增殖實驗，簡述如下：取處于對數(shù)生長期的細胞，細胞常規(guī)消化后接種于96孔板中，調(diào)整細胞密度至1×104個/孔，并向每孔加入200μl含10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液。置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分別于12、24、48、72 h向每孔加入5 mg/ml的MTT試劑20μl后，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄除原培養(yǎng)液后，每孔加入150μl的二甲基亞砜（DMSO）溶液，室溫下振蕩10 min使形成的紫色甲瓚結(jié)晶充分溶解。酶標儀490 nm檢測每孔吸光度值（A490）。根據(jù)公式：（正常對照組A490-實驗組A490）/正常對照組A490，計算并分析各組細胞的增殖率。每組設定5個復孔，實驗單獨重復3次。

1.2.4 Transwell細胞侵襲實驗 參考文獻［12］進行Transwell細胞侵襲實驗，簡述如下：基質(zhì)膠4℃溶解后，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基以1：5進行稀釋，并取40μl稀釋后的基質(zhì)膠包被Transwell上室，于37℃下靜置4 h，使基質(zhì)膠凝固后備用。收集處于對數(shù)生長期的HEC-1A細胞，用含1%FBS與1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液進行饑餓培養(yǎng)24 h后，用0.25%胰酶進行常規(guī)消化，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整密度至4×105個/ml。向Transwell小室中加入無血清細胞懸液200μl，下室加入500μl含10%FBS的常規(guī)DMEM/F12培養(yǎng)液。每組設定3個復孔，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出上室，PBS沖洗2次，并用濕棉簽輕輕擦拭小室上層未穿出細胞，無水酒精固定15 min，室溫下晾干。0.1%結(jié)晶紫于室溫下染色30 min，PBS沖洗2次后于倒置顯微鏡下觀察穿出細胞數(shù)，每組隨機選取5個視野進行計數(shù)。實驗單獨重復3次。

1.2.5 細胞劃痕實驗 參考文獻［13］進行細胞劃痕實驗，簡述如下：預先在6孔板每個孔底部使用marker筆劃2條間隔為5 mm的橫線，再將細胞接種于6孔板中，每孔加入2 ml含10%FBS與1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液，并使每孔細胞達2×105個，于37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，待細胞密度達到80%左右時使用200μl移液器槍頭在細胞培養(yǎng)面垂直于marker筆劃線，PBS沖洗細胞3次以去除刮除掉的細胞。再向每孔加入含2%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下拍攝，使用Image J軟件測量細胞間距離并進行分析。實驗單獨重復3次。

1.2.6 Annexin V-FITC細胞凋亡實驗 參考相關文獻［10］進行Annexin V-FITC細胞凋亡實驗，簡述如下：收集處于對數(shù)生長期的細胞，每孔加入1 ml的0.25%胰酶進行常規(guī)消化，收集細胞懸液至5 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min，棄上清，取細胞沉淀并加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至7×105個/ml，并依次加入5μl An?nexin V-FITC及10μl的碘化丙啶（PI）染色液，輕輕搖晃離心管以充分混勻后，室溫下避光孵育半小時。最后流式細胞儀檢測。實驗單獨重復3次。

1.2.7 RT-qPCR實驗 參考文獻［10］進行RT-qP?CR實驗，簡述如下：收集處于對數(shù)生長期的細胞，按照Trizol法提取組織或細胞中總RNA，經(jīng)純度檢測與定量后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再按照RT-PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行實時定量，RT-PCR反應條件為：95℃（10 min）預變性后，變性95℃（7 s）→退火60℃（20 s）→72℃（38 s），40個循環(huán)周期。RT-PCR引物為：miR-29a上游引物5'-CGACTCTAGAAACACAAGAGCA-3'，下 游 引 物5'-AAGGTTAGCTTACTGTCACAC?GCTT-3'；PI3K上 游 引物5'-ATACCGCGGACTGT?GTTTCCAGTACACCT-3'，下 游 引 物5'-ACTGT?GTTTCCAGTACACCTACTGACCGTGACATCCTC-3'；GAPDH上游引物5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下 游 引 物5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-??Ct方法分析相關基因的表達量。

1.2.8 雙熒光素酶基因報告實驗 參考文獻［11］進行雙熒光素酶基因報告實驗，簡述如下：采用miR?NA靶基因在線數(shù)據(jù)庫TargetScan預測miR-29a靶基因并篩選PI3K進行驗證。取處于對數(shù)生長期的HEC-1A細胞，調(diào)整細胞密度為2×104個/孔，接種于96孔板中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞完全貼壁后，利用Lipofectamine2000將PI3K野生型（WT）及突變型（MUT）熒光素酶報告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入HEC-1A細胞中，再將miR-29a mimic及mimic-scramble分別轉(zhuǎn)入PI3K野生型及突變型細胞中，每組設5個復孔，轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測PI3K啟動子的熒光強度。

1.2.9 Western blot實驗 參考文獻［14］進行West?ern blot實驗，簡述如下：收集處于對數(shù)生長期的細胞，4℃預冷的PBS洗滌細胞3次后，加入RIPA細胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取細胞總蛋白。BCA法進行蛋白定量，按照1：4向上清液中加入5×蛋白上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。取35μg的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h，分別加入PI3K（1：800），p-AKT（1：500）、mTOR（1：500）、GAPDH（1：1 000）一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標記的二抗（1：5 000）室溫孵育1 h，用TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值作為其相對含量。上述實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0和GraphPad Prism5.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行多組間分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。顯著性檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-29a在EC組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的差異表達 采用miRNA芯片篩選出在EC組與正常對照組的子宮內(nèi)膜組織中差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)有36種miRNAs存在不同程度的差異性表達，將差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2作為篩選標準，同時選取在3例EC患者中表達一致下調(diào)的，且下調(diào)趨勢最為顯著（大于3倍）的miR-29a進行研究。隨后通過RT-PCR實驗對所有15例內(nèi)膜癌組織與正常對照組織進行檢測，結(jié)果表明與正常對照組相比，miR-29a在EC患者的內(nèi)膜組織表達顯著降低（P=0.021）。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-29a mimic/inhibitor后EC細胞中miR-29a的表達 HEC-1A細胞在轉(zhuǎn)染miR-29a mimic、inhibitor后，RT-PCR實驗結(jié)果顯示，與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞中miR-29a的表達顯著升高（P=0.019），而miR-29a in?hibitor組HEC-1A細胞中miR-29a的表達明顯降低（P=0.021），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞中miR-29a的表達無明顯變化（P=0.887、P=0.925）。見圖2。

圖1 miR-29a在EC中異常低表達Fig.1 miR-29a was significantly under-expressed in EC tissue

圖2 轉(zhuǎn)染miR-29a mimic/inhibitor后EC細胞中miR-29a的表達Fig.2 Expression level of miR-29a in EC cells after trans?fection with miR-29a mimic/inhibitor

2.3 miR-29a對EC細胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞增殖能力明顯減弱（P=0.011），而miR-29a inhibitor組細胞增殖能力顯著增強（P=0.038），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞的增殖能力無明顯變化（P=0.753、P=0.696）。見圖3。

2.4 miR-29a對EC細胞侵襲能力的影響 Tran?swell實驗結(jié)果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞的侵襲能力顯著下降（P=0.004），miR-29a inhibitor組細胞的侵襲能力明顯增強（P=0.008），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞的侵襲能力無明顯變化（P=0.871、P=0.834）。見圖4。

2.5 miR-29a對EC細胞遷移能力的影響 遷移實驗結(jié)果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞遷移能力顯著下降（P=0.004），miR-29a inhibitor組細胞遷移能力明顯增強（P=0.027），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞的遷移能力無明顯變化（P=0.468、P=0.620）。見圖5。

2.6 miR-29a對EC細胞凋亡的影響 Annexin VFITC凋亡實驗結(jié)果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29amimic組細胞凋亡發(fā)生率顯著升高（P=0.007），miR-29a inhibitor組細胞凋亡發(fā)生率明顯降低（P=0.029），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞的凋亡發(fā)生率無明顯變化（P=0.943、P=0.886）。見圖6。

圖3 miR-29a對EC細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of miR-29a on proliferation of EC cells

圖4 miR-29a對EC細胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of miR-29a on invasion of EC cells

2.7 miR-29a在EC細胞中與PI3K的靶向關系 miRNA靶基因在線數(shù)據(jù)庫TargetScan結(jié)果顯示PI3K基因的3′-UTR區(qū)存在能與miR-29a的結(jié)合序列，這提示PI3K基因可能為miR-29a的潛在靶基因。利用雙熒光素酶基因報告實驗進行驗證，如圖7B所示，與mimic-scramble相比，miR-29a mimic能使PI3K-WT組的熒光酶活性顯著降低（P=0.021），而PI3K-MUT組的熒光酶活無明顯變化（P=0.447）。見圖7。

圖5 miR-29a對EC細胞遷移能力的影響Fig.5 Effect of miR-29a on migration of EC cells

圖6 miR-29a促進EC細胞發(fā)生凋亡Fig.6 Effect of miR-29a on EC cell apoptosis

2.8 miR-29a對EC細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示與正常對照組HEC-1A細胞相比，miR-29a mimic組細胞中PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達均明顯降低（P=0.023、P=0.037、P=0.019），而miR-29a inhibitor組細胞中PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表達均顯著增加（P=0.044、P=0.039、P=0.028），mimic-scramble及inhibitor-scramble組細胞中上述蛋白均無明顯變化（P=0.573、P=0.639、P=0.954與P=0.125、P=0.944、P=0.778）。見圖8。

圖7 miR-29a在EC細胞中靶向調(diào)控PI3K的表達Fig.7 miR-29a targets expression of PI3K in EC cells

3 討論

EC是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一種上皮惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女，常表現(xiàn)為陰道不規(guī)則出血或流液［12］。據(jù)報道，每年有接近20萬的新發(fā)病例，且發(fā)病年齡日趨年輕化，嚴重危害女性身體及生殖健康［2］。miRNA是近年來癌癥研究的熱點，因其具有多靶點及組織特異性等特點，使其調(diào)控網(wǎng)絡復雜龐大，且研究證實多種腫瘤具有其特征性的miRNA表達譜，如在乳腺癌、胃癌、肺癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)特異性表達差異的miRNAs［6，15-17］。miRNA在腫瘤細胞中通過調(diào)控其下游靶基因，參與調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、侵襲、凋亡等多種生物學行為，從而發(fā)揮促癌或抑癌基因的作用［13］。GONG等［18］發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中miR-29a表達顯著下調(diào)，進一步研究證實miR-29a通過下調(diào)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNM1）的表達，下調(diào)細胞因子信號傳導抑制因子1（SOCS1）的啟動區(qū)甲基化水平，從而調(diào)控宮頸癌細胞的增殖、侵襲及凋亡等生物學行為，最終發(fā)揮抑癌基因的作用。在膠質(zhì)瘤組織中，miR-29a表達水平同樣存在顯著降低現(xiàn)象，其可能通過負向調(diào)控參與腫瘤免疫逃逸的重要負性因子B7-H3（CD276）的表達，進而下調(diào)趨化因子CXCR4，最終抑制膠質(zhì)瘤細胞惡性侵襲能力［14］。在肝癌中，miR-29a通過靶向抑制細胞間連接蛋白CLDN1的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長及遷移［19］。本研究通過基因芯片篩選EC患者與健康對照組子宮內(nèi)膜中差異性表達的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR29a顯著低表達于EC患者的子宮內(nèi)膜組織中，同時PR-PCR實驗結(jié)果同樣證實，在EC細胞系HEC-1A中miR29a的表達亦顯著降低。為進一步明確miR-29a是否影響EC的發(fā)生發(fā)展，我們又通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術對HEC-1A細胞中miR-29a進行過表達或抑制處理，并利用MTT、Transwell、劃痕實驗及Annexin V-FITC凋亡實驗分別檢測miR-29a對EC細胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響，結(jié)果顯示過表達EC細胞中的miR-29a，可明顯抑制細胞的增殖、侵襲、遷移能力，并促進細胞發(fā)生凋亡，而抑制其表達，EC細胞的增殖、侵襲、遷移能力顯著提高，且細胞的凋亡率明顯下降。生物信息學結(jié)果顯示PI3K可能是miR-29a的潛在靶基因，雙熒光素酶基因報告實驗及Western blot驗證了兩者的靶向關系。這提示在EC中，miR-29a可能通過下調(diào)PI3K的表達，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移能力，促進其發(fā)生凋亡。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號通路在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要地位，且該通路與細胞生存、增殖及凋亡等生物學行為密切相關［20］。磷脂酰肌醇-3（phos?phatidyl inositol 3-kinase，PI3K）是一種異質(zhì)二聚體，其通過與細胞表面各種受體如生長因子、G蛋白偶聯(lián)受體等相互作用，引起自身構象的改變而被激活［21］。激活的PI3K通過磷酸化細胞內(nèi)的第二信使4，5-二磷酸酯酰肌醇，并使其活化下游的主要效應蛋白——蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）從細胞膜轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)，并促使構象改變，發(fā)生磷酸化（p-AKT）而被激活。而激活后的p-AKT通過啟動下游靶基因mTOR，從而參與調(diào)節(jié)促進細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學行為［22］。最新的研究表明，促進PI3K/AKT/mTOR信號通路同樣能夠增強針對腫瘤的固有免疫反應，進而加強機體對腫瘤的免疫監(jiān)視來延緩病情的進展［23］，如在黑色瘤的小鼠模型中，應用PI3K抑制劑GSK2636771能夠顯著促進腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤，延緩小鼠的生存期［24］。本研究通過Western blot實驗在過表達與抑制miR-29a表達的EC細胞中檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路PI3K、p-AKT、mTOR蛋白的表達，結(jié)果顯示上調(diào)EC細胞中miR-29a的表達，可明顯抑制PI3K、p-AKT、mTOR的表達，而抑制細胞中miR-29a的表達，PI3K、p-AKT、mTOR的表達卻顯著增強。這提示在EC中，miR-29a可能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路影響腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡能力。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌中低表達miR-29a可能通過抑制PI3K的表達，從而下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路，抑制內(nèi)膜癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，并促進細胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮著抑癌基因的作用。本研究證實miR-29a是子宮內(nèi)膜癌中重要的抑癌miRNA，糾正EC中miR-29a的異常低表達可能成為子宮內(nèi)膜癌基因治療的有效手段。眾所周知，腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展的土壤，其主要由免疫細胞、成纖維細胞及細胞外基質(zhì)等成分共同構成［25］，而鑒于miR-29a及靶基因PI3K在腫瘤相關免疫中的重要地位，下一步我們課題組將從miR-29a是否能夠通過PI3K/AKT/mTOR信號通路影響腫瘤微環(huán)境中的相關免疫細胞功能方面繼續(xù)深入探究miR-29a在EC中的其他作用，以期為針對miR-29a在子宮內(nèi)膜癌中的靶向治療提供新的證據(jù)。