大黃素通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1和MAPKs抑制炎癥和氧化應(yīng)激機(jī)制研究①

張昊悅 趙 蓓 王業(yè)皇 章 陽(yáng)（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院肛腸中心，南京210000）

炎性腸病是一系列導(dǎo)致多種并發(fā)癥的疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，其中最常見(jiàn)的是腸纖維化和癌癥［1］。潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病患者的黏膜炎癥常表現(xiàn)為固有層淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)［2］。巨噬細(xì)胞在維持腸道穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，并且被認(rèn)為是炎性腸病的關(guān)鍵參與者。經(jīng)典激活的M1型產(chǎn)生一氧化氮、活性氧和促炎細(xì)胞因子，活動(dòng)期炎性腸病患者腸道黏膜中的一氧化氮表達(dá)驟增，可抑制超氧化物歧化酶（su?peroxide dismutase，SOD）活性、促使脂質(zhì)自由基形成，導(dǎo)致腸黏膜通透性增加、黏膜屏障功能受損［3］。并且它在諸如傷口愈合和組織的建設(shè)過(guò)程中起維修作用［4］。因此抑制巨噬細(xì)胞M1型活化可影響炎性腸病的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激是指機(jī)體受到多種病理因素刺激后，體內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)多，抗氧化能力下降，打破了機(jī)體正常氧化還原動(dòng)態(tài)平衡，造成生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等的氧化損傷，干擾正常生命活動(dòng)而形成的一種嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)［5］。ROS來(lái)源增多和抗氧化能力降低是導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平增高的主要機(jī)制，Nrf2信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激最重要的防御系統(tǒng)之一，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，Nrf2信號(hào)通路首先被激活，進(jìn)而引發(fā)抗氧化物及相關(guān)酶類(lèi)的大量表達(dá)，以抵御氧化應(yīng)激引發(fā)的細(xì)胞損傷，減少ROS產(chǎn)生［6］。Nrf2可以調(diào)控具有重要的抗氧化和抗炎活性的HO-1，而HO-1在大鼠結(jié)腸炎模型有重要保護(hù)作用，HO-1的表達(dá)能抑制促炎介質(zhì)的產(chǎn)生［7-8］。

盡管已開(kāi)發(fā)出各種抗炎藥物，例如水楊酸類(lèi)制劑、硫唑嘌呤等免疫抑制劑藥物和生物制劑，但由于這些藥物的肝腎損傷、過(guò)敏反應(yīng)等副作用較多，目前仍需要研發(fā)具有抗炎作用同時(shí)減少副作用的中藥單體。

大黃素（Emodin，1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌）是一種常見(jiàn)的蒽醌衍生物，據(jù)報(bào)道具有多種生物學(xué)特性，例如抗炎、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化活性［9-12］。根據(jù)文獻(xiàn)所知大黃素能夠通過(guò)抗氧化和抗炎活性減輕重癥急性胰腺炎，大黃素可以通過(guò)上調(diào)lncRNA TUG1抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠軟骨ATDC5細(xì)胞凋亡和炎癥［13-14］。大黃素可通過(guò)抑制大鼠結(jié)腸炎NF-κB炎癥通路產(chǎn)生抗炎作用，但是關(guān)于大黃素對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道［15］。但是大量文獻(xiàn)表明天然蒽醌類(lèi)藥物能夠抑制細(xì)胞體內(nèi)的ROS［16］。本研究擬探討大黃素能否通過(guò)Nrf-2/HO-1和MAPKs抑制炎癥，并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物和細(xì)胞 中藥單體大黃素（中國(guó)藥檢所）；小鼠單核巨噬細(xì)胞系（RAW264.7）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上?？茖W(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。用含有10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.1.2 主要試劑 CCK8試劑盒（同仁化學(xué)研究所）；Griess試劑盒（上海碧云天）；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Solarbio公司）；RNA提取試劑（美國(guó)Sigma公司）；Perfect real time-PCR試劑盒（日本Ta?KaRa公司）；SYBR Green RCR Kit（QuantiNova公司）；PCR引物設(shè)計(jì)和合成（生工生物工程有限公司）；核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）（1∶1 000）、血紅素氧化酶1（hemeoxy?genase1，HO-1）（1∶1 000）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）及其磷酸化（pERK）（1∶1 000）、p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38）及其磷酸化（pP38）（1∶1 000）和GAPDH抗體（CST）（1∶1 000），均為兔抗，兔二抗（美國(guó)Jackson ImmunoResearch Laboratories）（1∶10 000）；超敏ECL化學(xué)反應(yīng)發(fā)光試劑盒（新賽美生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；Cytoflex流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾德公司）。

1.2 方法

1.2.1 CCK8法測(cè)定大黃素對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性影響 將RAW264.7，接種于96孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中孵育12 h。加入不同濃度的大黃素繼續(xù)培養(yǎng)24 h，濃度為25、50、100、200、300μmol/L，設(shè)定3個(gè)平行組，24 h后，每孔加入10μl的CCK8試劑，放置培養(yǎng)箱孵育1.5 h，酶標(biāo)儀（450 nm）測(cè)吸光度值（A）。細(xì)胞活力計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）＝各濃度給藥組的A值/空白組的平均A值×100%。

1.2.2 Griess法檢測(cè)大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥介質(zhì)NO的影響 RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)基，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。過(guò)夜后細(xì)胞貼壁，棄掉培養(yǎng)基后，分別設(shè)置對(duì)照組、LPS（LPS1μg/ml）、大黃素低劑量組（LPS1μg/ml+大黃素20μmol/L），大黃素高劑量組（LPS1μg/ml+大黃素40μmol/L）。加入各組藥物后孵育24 h后，吸取50 μl的上清液至空白的96孔板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別加入50μl Griess試劑A和Griess試劑B，孵育10 min，用酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每組的NO的含量。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞的IL-6、iN?OS、IL-1βmRNA的含量 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板，分組及處理同1.2.2，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)過(guò)夜。加藥處理24 h后收集各組RNA樣品。用Trizol提取方法細(xì)胞總的RNA，用Perfect Real Time試劑盒逆轉(zhuǎn)錄提取總cDNA，反應(yīng)體系37℃、15 min，85℃5 s，4℃保存，后用RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)（引物如表1）。PCR反應(yīng)條件：95℃2 min，95℃5 s，60℃10 s，共40個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次，β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)標(biāo)基因。使用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA含量。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大黃素對(duì)RAW264.7細(xì)胞ROS的影響 細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.2.2，作用24 h后，收集細(xì)胞，用4℃PBS沖洗2次，10μmol/L DCF-DA 37℃孵育30 min后，用PBS清洗2遍，流式上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞表面膜蛋白CD86的影響 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理同1.2.2。用預(yù)冷的PBS沖洗2遍，PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，取100μl到流式管中，加入PE抗鼠CD86抗體以及IgG2a的同型對(duì)照組，4℃避光孵育20 min；1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，棄上清，再加入200μl的PBS；用Cytoflex流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以Flow Jo軟件分析結(jié)果。

1.2.6 檢測(cè)大黃素作用于RAW264.7細(xì)胞Nrf-2/HO-1蛋白表達(dá) RAW264.7細(xì)胞鋪于6孔板，加入不同組別的藥物作用，24 h后，消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，每孔加入RIRA裂解液100μl，收集細(xì)胞于1.5 ml離心管中。冰上放置30 min，然后4℃，12 000 g離心15 min，取上清液，蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。加入蛋白上樣緩沖液，金屬浴10 min變性。使用10%SDS-PAGE電泳分離，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h；4℃過(guò)夜孵育一抗（1∶1 000），一抗為Nrf-2和HO-1。TBTS溶液洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗（1∶20 000）1 h；TBST溶液洗3次，每次10 min，然后使用ECL發(fā)光法檢測(cè)蛋白。使用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.2.7 檢測(cè)大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理同1.2.2。后續(xù)處理同1.2.6，一抗為pERK、ERK、pP38和P38，內(nèi)參為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件分析，獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)分析，計(jì)量資料用±s描述，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性作用 大黃素在濃度為0～40μmol/L時(shí)對(duì)正常的RAW264細(xì)胞活力無(wú)毒性作用，超過(guò)40μmol/L，細(xì)胞活力下降（見(jiàn)圖1）。所以本研究選用了20、40μmol/L兩個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.2 大黃素抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-6、iNOS、IL-1βmRNA表達(dá) 根據(jù)圖2可以得知，LPS組中IL-6、iNOS、IL-1β細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；大黃素組與LPS組相比，炎癥因子IL-6、iNOS和IL-1β mRNA隨著藥物劑量的增加而降低，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.3 大黃素對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO含量的影響如圖3所示，與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的炎癥RAW264.7細(xì)胞中NO含量明顯增加；與LPS組比較，不同濃度作用的大黃素中NO含量明顯降低（P＜0.001），且具有濃度依賴性。

2.4 大黃素抑制LPS誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生 圖4結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS單獨(dú)處理組的ROS含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大黃素組與LPS組相比能夠明顯的抑制ROS生成（P＜0.001），且具有濃度依賴性。

2.5 大黃素對(duì)RAW264.7膜表面蛋白CD86的影響 如圖5可知，LPS組高表達(dá)CD86膜表面蛋白分子，和對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。給予大黃素干預(yù)極化的RAW264.7細(xì)胞，RAW264.7細(xì)胞的CD86明顯的降低，且具有濃度依賴性。

圖1 大黃素對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of Emodin on activity of RAW264.7 cell

2.6 大黃素能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的Nrf-2/HO-1蛋白的表達(dá) 由圖6可知，LPS組的Nrf-2和HO-1蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。大黃素組與LPS組相比，能顯著Nrf-2和HO-1蛋白的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），且存在濃度依賴性。

2.7 大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響 如圖7所示，與對(duì)照組相比，LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞，ERK、p38磷酸化水平明顯升高（P＜0.01），與LPS組相比，大黃素組的ERK、p38磷酸化水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明大黃素能夠抑制MAPK的信號(hào)通路。

圖2 大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-6、iNOS、IL-1βmRNA的影響Fig.2 Effect of Emodin on IL-6，iNOSand IL-1βmRNA in LPS-induced RAW264.7 cell

圖3 大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響Fig.3 Effect of Emodin on NO production in LPS-in?duced RAW264.7 cell

圖4 大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響Fig.4 Effect of Emodin on ROS production in LPS-in?duced RAW264.7 cell

圖5 大黃素對(duì)于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞膜蛋白CD86的影響Fig.5 Effect of Emodin on CD86 in LPS-induced RAW-264.7 cell

圖6 大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of Emdin on expression of Nrf2，HO-1 in LPSindued RAW264.7 cell

圖7 大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞ERK、P38磷酸化蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of Emodin on expression of p ERK，p P38 in LPS-induced RAW264.7 cell

3 討論

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是炎癥和先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞［17］。巨噬細(xì)胞可由革蘭氏陰性菌的脂多糖LPS等有害物刺激產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如NO，iNOS，IL-6和IL-1β等［18］。這些促進(jìn)炎癥的介質(zhì)大量產(chǎn)生導(dǎo)致了炎癥［19-20］。因此大量研究在尋找這些促炎介質(zhì)的抑制劑和抗炎促進(jìn)劑［20］。

脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型是經(jīng)典的體外炎癥模型。LPS是被Toll樣受體4（TLR4）識(shí)別并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并能活化細(xì)胞的核因子κ輕鏈增強(qiáng)子（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶K（MAPK）；當(dāng)MAPK相關(guān)蛋白如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38 MAPK）信號(hào)激活，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物中的炎性介質(zhì)如一氧化氮表達(dá)（NO）的產(chǎn)生，活化的巨噬細(xì)胞上的TNF-α和IL-6升高，同時(shí)能夠上調(diào)活性氧（ROS）［20-24］。ROS又稱(chēng)活性氧，其產(chǎn)生與炎癥密切相關(guān)，炎性腸病中，活化的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞會(huì)持續(xù)過(guò)量產(chǎn)生ROS，使炎癥條件和不受控制的免疫系統(tǒng)氧化負(fù)荷增加［25］。炎性腸病的發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)高水平的ROS，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致體內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失，隨后出現(xiàn)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，包括脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、蛋白質(zhì)修飾和促炎癥細(xì)胞因子的過(guò)度生成［26］。同時(shí)局部炎癥細(xì)胞因子水平升高，特別是IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23、IFN-γ和TNF-α，是炎性腸病免疫系統(tǒng)失控的重要特征［27］。因此本研究采用了這個(gè)模型模擬了炎性腸病疾病過(guò)程中發(fā)生的炎癥反應(yīng)。

研究報(bào)道，一切抗氧化酶，如血紅素加氧酶（HO-1），參與iNOS和NO的調(diào)控作用，生理狀態(tài)下HO-1低表達(dá)，可因?yàn)槿毖鹾蚏OA等刺激后可迅速增加，HO-1增加有助于細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)，HO-1能夠保護(hù)RAW264.7免受ROS的攻擊，HO-1是核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路的下游蛋白HO-1主要受Nrf2的調(diào)控，所以Nrf2/HO-1和MAPK通路一樣，都能夠抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)［28-29］。最近，一些關(guān)于炎性腸病的研究將注意力集中在Nrf-2上，它是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與了包括腸道在內(nèi)的許多器官的纖維化過(guò)程，同時(shí)已經(jīng)證實(shí)Nrf-2參與了包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［29-31］。

大量研究證實(shí)了很多中藥及其主要活性都具有能夠抑制炎癥和氧化應(yīng)激［32-34］。本研究采用了LPS刺激RAW264.7細(xì)胞制備體外炎癥模型。大黃素對(duì)于RAW264.7具有低細(xì)胞毒性，可以抑制LPS誘 導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞，降 低IL-6、iNOS、IL-1β mRNA的表達(dá)，且抑制效應(yīng)呈一定的濃度依賴性。研究表明天然蒽醌類(lèi)藥物能夠抑制RAW264.7中ROS的產(chǎn)生［16］。與此同時(shí)，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大黃素能使細(xì)胞中ROS和NO水平顯著降低和細(xì)胞膜蛋白CD86含量的減少，表明大黃素具有抗炎作用，能夠降低由LPS引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明大黃素在體外能夠通過(guò)抑制TLR4信號(hào)通路減輕LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷，可以降低體內(nèi)外TLR4下游蛋白的水平，并且還能抑制細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清中TNF-α和IL-6的表達(dá)［35］。大黃素能夠大黃素通過(guò)PPARγ依賴途徑抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥［36］。雖然大黃素對(duì)已經(jīng)證實(shí)了對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗炎效應(yīng)，但是對(duì)抑制RAW264.7細(xì)胞的炎癥和ROS的表達(dá)沒(méi)有做深入的機(jī)制研究，所以我們對(duì)此進(jìn)行了探討。為了進(jìn)一步闡明大黃素在介導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)中的分子機(jī)制，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)大黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)后的RAW264.7的Nrf-2、HO-1和MAPK通路表達(dá)的影響。本研究結(jié)果顯示大黃素能夠顯著增加由LPS誘導(dǎo)的后細(xì)胞中Nrf-2、HO-1的蛋白表達(dá)，對(duì)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。同時(shí)大黃素還能夠通過(guò)抑制MAPK通路的活化從而對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到抑制作用。

綜上所述，大黃素能夠調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)和MAPK信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激作用，這些信號(hào)通路與炎性腸病密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步探索了大黃素體外抗炎的活性及其機(jī)制，為大黃素治療炎性腸病提供證據(jù)，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。