腎缺血后處理通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路減輕大鼠腎缺血再灌注損傷①

李 惠 劉建林 牛 聰 張 威 王慧超（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，開封475000）

缺血再灌注損傷是急性腎損傷和慢性腎病的主要原因之一，包括腎纖維化，常由低血容量、感染性休克、意外或醫(yī)源性創(chuàng)傷、心血管手術(shù)和腎臟手術(shù)引起［1］。缺血組織的再灌注過程至關(guān)重要，然而缺血過程會(huì)導(dǎo)致再灌注損傷。缺血再灌注損傷通過直接誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞死亡而引起腎小管的結(jié)構(gòu)和功能損傷，這些死亡細(xì)胞可能引起腎小管的損傷響應(yīng)［2］。缺血再灌注損傷是移植過程中不可避免的現(xiàn)象，隨著腎臟缺血再灌注的重要性越來越明顯，開發(fā)新的治療方法來預(yù)防缺血再灌注引起的腎臟損害是非常有必要的［3］。缺血后處理是在缺血組織或器官再灌注早期進(jìn)行多次快速間歇阻斷血流，從而機(jī)械地改變?cè)俟嘧⒌牧黧w動(dòng)力學(xué)，相比缺血預(yù)處理，缺血后處理更具有臨床應(yīng)用價(jià)值［4］。相關(guān)研究表明缺血后處理能減輕腎臟缺血再灌注損傷，其機(jī)制與抑制p38 MAPK活化，進(jìn)而抑制炎癥因子釋放有關(guān)［5］。本文旨在探討腎缺血后處理通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只SD大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雄性，體重（200±20）g，常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和主要試劑 全自動(dòng)生化分析儀（TBA-40FR）購(gòu)自日本東芝；熒光顯微鏡（DM1000）購(gòu)自德國(guó)徠卡；SOD測(cè)定試劑盒（A001-3-2）、MDA測(cè)定試劑盒（A003-1-2）、LDH試劑盒（A020-2-2）均購(gòu)自南京建成；BCA試劑盒（ab102536）購(gòu)自美國(guó)Abcam；HE染色試劑盒（C0105）、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1091）、p38 MAPK（SD5928）購(gòu)自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與分組 戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉大鼠，對(duì)所有大鼠進(jìn)行中線剖腹手術(shù)和右腎切除術(shù)，方法為行腹中線4～5 cm縱切口，暴露腹腔，將小腸、結(jié)腸、脾臟推到左側(cè)，分離右腎，結(jié)扎腎蒂，將右腎取出。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組（n=10）：①假手術(shù)組（sham）：暴露左腎，不作處理使左腎動(dòng)脈血流正常；②腎缺血再灌注組（I/R）［6］：暴露左腎，用非創(chuàng)傷性血管鉗夾緊左腎動(dòng)脈，誘導(dǎo)缺血50 min，松開動(dòng)脈后，再灌注24 h；③腎缺血后處理組（RI-Post）：暴露左腎，用非創(chuàng)傷性血管鉗夾緊左腎動(dòng)脈，誘導(dǎo)缺血50 min，松開動(dòng)脈后，再灌注的同時(shí)用非創(chuàng)傷性血管鉗反復(fù)夾閉左腎動(dòng)脈，重復(fù)3次，每次20 s。

模型建立24 h后從各組大鼠下腔靜脈抽取靜脈血2～4 ml置于抗凝管內(nèi)，靜置4 h后分離血清，-70℃保存待用，并刺激大鼠留尿于干凈玻璃板上，用無菌注射器收集約0.2～0.5 ml。處死所有大鼠，取左腎組織分成2份進(jìn)行石蠟切片和制作腎組織勻漿。

1.2.2 腎功能指標(biāo) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)尿液中蛋白尿含量，分離后的血清采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肌酐酸、尿素氮水平。

1.2.3 HE染色 取各組大鼠腎組織先用10%甲醛固定48 h，然后石蠟包埋制作切片，切片厚5μm。然后用蘇木精、伊紅染色。在400×熒光顯微鏡下觀察腎組織損傷情況。參照J(rèn)ABLONSKI［7］方法對(duì)腎小管損傷評(píng)分。

1.2.4 TUNEL染色 大鼠腎組織切片用二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇脫水。用蛋白酶K工作液在37℃下封閉20 min，PBS清洗2次。在每個(gè)切片樣本上加入50μl TUNEL反應(yīng)液，37℃避光反應(yīng)60 min。用DAPI復(fù)染10 min后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫組化 將切片先脫蠟處理后用PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，切片經(jīng)3%過氧化氫處理后，再用山羊血清封閉。然后用抗BAX初級(jí)抗體孵育過夜，次日用PBS沖洗3次，每次5 min，最后加入辣根過氧化物酶（HRP）二抗孵育30 min，室溫下用DBS顯色。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒說明書檢測(cè)腎組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD（WST-1法）、MDA（TBA法）、LDH（微板法）水平。

1.2.7 Western blot 取腎組織用BCA試劑盒提取總蛋白，并檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品，在100℃條件下變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4℃條件下加入相應(yīng)一抗并孵育過夜，清洗，然后在4℃條件下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，洗膜后采用ECL法顯色、拍照觀察膠片上的條帶，并用Image-Pro Plus軟件對(duì)掃描圖像進(jìn)行灰度分析，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量用各目的條帶與β-actin的灰度值比值來表示。

1.2.8 加入P38MAPK抑制劑SB203580對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠模型的影響 參照方法1.2.1構(gòu)建腎缺血再灌注大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為4組：sham組、I/R組、SB組、SB+RI-Post組。SB組大鼠腹腔注射P38抑制劑SB203580 400μg/kg，SB+RI-Post組在缺血后處理后腹腔注射P38抑制劑SB203580400μg/kg。檢測(cè)各組大鼠腎組織病理?yè)p傷，蛋白尿、血清肌酸酐、尿素氮水平和氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示，P＜0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎缺血后處理降低腎缺血再灌注大鼠模型蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮水平 檢測(cè)各組SD大鼠24 h蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮的水平，結(jié)果如圖1所示，I/R組尿素氮水平顯著高于sham組（P＜0.01），RI-Post組尿素氮水平顯著低于I/R組（P＜0.01），I/R組24 h蛋白尿水平顯著高于sham組與RI-Post組（P＜0.01）。sham組血清肌酐酸水平顯著低于I/R組（P＜0.01），RI-Post組血清肌酐酸水平顯著低于I/R組（P＜0.01），說明I/R組腎損傷情況高于RI-Post組與sham組。

2.2 腎缺血后處理改善腎缺血再灌注大鼠病理?yè)p傷程度 為了檢測(cè)腎缺血后對(duì)腎組織損傷的影響，本研究采用HE染色檢測(cè)腎組織損傷情況。結(jié)果如圖2所示，I/R組較sham組腎組織病理改變明顯，呈現(xiàn)腎小管腫脹，細(xì)胞核移位，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，間質(zhì)充血，腎小管管腔內(nèi)有壞死碎片，且腎小管損傷評(píng)分顯著升高（P＜0.01，圖3）。RI-Post組較I/R組，腎組織損傷情況明顯減輕且腎小管損傷評(píng)分顯著降低（P＜0.01）。TUNEL陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞核呈深染棕色。如圖所示，I/R組陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于sham組（P＜0.01），RI-Post組陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于I/R組（P＜0.01）。Caspase-3的免疫組化陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，少數(shù)也見于胞核，呈棕褐色。sham組與RIPOST組陽(yáng)性表達(dá)率均顯著低于I/R組（P＜0.01）。說明腎缺血后處理較腎缺血后灌注可以明顯降低腎組織的損傷程度。

2.3 腎缺血后處理降低腎缺血再灌注大鼠模型SOD、MDA、LDH水平 檢測(cè)各組氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、LDH，如圖4所示，與sham組相比，I/R組SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA水平和LDH水平顯著升高（P＜0.01），RI-Post組較I/R組SOD活性顯著升高（P＜0.01），MDA、LDH水平顯著降低（P＜0.01）。說明腎缺血后處理可能降低腎缺血后再灌注氧化應(yīng)激水平。

2.4 腎缺血后處理抑制p38 MAPK信號(hào)通路 為了研究腎缺血后細(xì)胞損傷變化的潛在機(jī)制，本文檢測(cè)p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK的表達(dá)情況，如圖5所示，sham組蛋白水平顯著低于I/R組（P＜0.01），I/R組蛋白水平顯著高于RI-Post（P＜0.01）。說明I/R組促進(jìn)p38 MAPK信號(hào)通路表達(dá)，而RI-Post組可能通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路表達(dá)降低腎組織損傷。

圖1 腎缺血后處理對(duì)腎缺血再灌注大鼠模型蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮水平的影響Fig.1 Effects of renal ischemia post-treatment on nitro?gen，proteinuria and serum creatinine levels in rat models after renal ischemia and reperfusion

圖2 腎缺血后處理對(duì)腎缺血再灌注大鼠模型腎組織損傷的影響（×400）Fig.2 Effects of renal ischemia post-treatment on renal tissue injury in rat model of renal ischemia reperfu?sion（×400）

圖3 腎缺血后處理對(duì)腎缺血再灌注大鼠模型腎小管損傷評(píng)分的影響Fig.3 Effect of renal ischemia post-treatment on renal tu?bule injury score in renal ischemia reperfusion rat model

圖4 腎缺血后處理對(duì)腎缺血再灌注大鼠模型SOD、MDA、LDH水平的影響Fig.4 Effects of renal ischemia post-treatment on levels of SOD，MDA and LDH in renal ischemia reperfu?sion rats

2.5 加入p38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠模型的影響 通過HE染色檢測(cè)各組大鼠腎組織損傷情況，結(jié)果如圖6A所示，SB+RIPost組較SB組病理?yè)p傷程度明顯改善，腎小管腫脹減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整；檢測(cè)各組大鼠尿素氮、24 h蛋白尿、血清肌酸酐水平，結(jié)果如圖6B～D所示，與sham組相比較，I/R、SB組尿素氮、24 h蛋白尿、血清肌酸酐水平顯著升高（P＜0.01）。與SB組相比較，SB+RI-Post組尿素氮、24 h蛋白尿、血清肌酸酐水平顯著降低（P＜0.01）；檢測(cè)各組氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、LDH，如圖6所示，與sham組相比較，I/R、SB組SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA、LDH水平顯著升高（P＜0.01）。與SB組相比較，SB+RI-Post組SOD活性顯著升高（P＜0.01），MDA、LDH水平顯著降低（P＜0.01）。

圖5 腎缺血后處理對(duì)腎缺血再灌注大鼠模型p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of renal ischemia post-treatment on expres?sion of p38 MAPK protein in renal ischemia reper?fusion rat model

圖6 加入p38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠模型的影響Fig.6 Effect of p38 MAPK inhibitor SB203580 on rat model of renal ischemia-reperfusion injury

3 討論

缺血再灌注損傷定義為組織器官經(jīng)過一定時(shí)間缺血后再恢復(fù)血液灌注后其代謝、功能和結(jié)構(gòu)的損傷反而加重，甚至出現(xiàn)不可逆損傷的現(xiàn)象［8］。細(xì)胞在缺血期缺乏氧氣，因此，代謝從需氧轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧糖酵解，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，酸中毒。ATP耗盡，細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+過載和抑制線粒體呼吸鏈，使細(xì)胞死亡發(fā)生在數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，這取決于細(xì)胞類型。因此，缺血后血流的恢復(fù)對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要。然而，缺血組織的再灌注常引起對(duì)細(xì)胞有害而非有益的效應(yīng)，這尤其適用于突然恢復(fù)氧氣（導(dǎo)致氧化應(yīng)激），氧自由基的釋放（可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡）和炎癥因子的釋放［9］。缺血再灌注損傷可導(dǎo)致器官功能障礙或衰竭，是移植、休克和大手術(shù)中的重要臨床問題。腎的高代謝和血管解剖學(xué)對(duì)缺血再灌注損傷特別敏感，嚴(yán)重缺血期是呈時(shí)間依賴性的：已經(jīng)證實(shí)15～20 min的缺血會(huì)對(duì)腎臟造成不可逆的損害［10］。

缺血后處理是一種短暫，相互作用的保護(hù)策略，缺血后處理應(yīng)用于缺血后再灌注的早期階段，RI-Post一直存在于各種動(dòng)物的各種器官中，呈現(xiàn)衰減I/R的作用，目前應(yīng)用于目標(biāo)器官、遠(yuǎn)端器官或組織時(shí)有效［11］。因此RI-Post為I/R患者提供了一種有廣泛前景的治療策略。WANG等［6］研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理和臭氧后處理可協(xié)同減輕腎缺血再灌注損傷。SEIFI等［12］研究發(fā)現(xiàn)腎缺血后處理對(duì)腎缺血再灌注損傷后肝臟遠(yuǎn)端器官具有保護(hù)作用。本文研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，腎缺血后處理可以減輕腎缺血再灌注損傷。

研究表明細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在I/R損傷期間調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞存活，其家族成員p38蛋白激酶（p38 MAPK）在各種細(xì)胞功能中起調(diào)節(jié)作用。p38 MAPK信號(hào)通路參與缺血再灌注損傷等多種因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)調(diào)控，通過p38 MAPK活化，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞激活釋放炎癥細(xì)胞因子參與細(xì)胞的損傷，說明阻斷p38 MAPK信號(hào)通路能減輕腎缺血再灌注損傷［13］。ZHOU等［14］研究發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白1通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路減弱心肌缺血再灌注損傷。JIANG等［15］研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK誘導(dǎo)的核因子激活B細(xì)胞活性的κ-輕鏈增強(qiáng)子是視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷中神經(jīng)保護(hù)所必需的。本研究中，觀察到I/R組的p38 MAPK表達(dá)顯著高于RI-Post組，提示腎缺血后處理可能通過抑制p38 MAPK的表達(dá)來減弱缺血再灌注的損傷，且加入P38MAPK抑制劑SB203580也證明了這一點(diǎn)。

綜上所述，腎缺血后處理可以降低腎缺血后再灌注氧化應(yīng)激水平，I/R組促進(jìn)p38 MAPK信號(hào)通路表達(dá)，RI-Post組可能通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路來降低表達(dá)。本文的研究結(jié)果闡明了腎缺血后處理可通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路減輕大鼠腎缺血再灌注的損傷程度。