膿毒癥患者外周血Th1/Th2和Th17/Treg平衡變化及臨床意義

王建峰，楊楠楠

(焦作市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河南 焦作 454000)

CD4+T細(xì)胞具有較高異質(zhì)性，根據(jù)其分泌細(xì)胞因子和不同功能可分為Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等亞群，在功能及分化中，Th1/Th2和Th17/Treg是2對(duì)互相拮抗的體系，在維持機(jī)體免疫平衡中具有主要作用，若出現(xiàn)失衡，則會(huì)引起免疫功能異常，發(fā)生免疫性、腫瘤、炎癥等疾病[1]。有研究證實(shí)[2]，Th1/Th2和Th17/Treg的平衡變化與肺癌、肝細(xì)胞癌、腎癌等癌癥的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有密切關(guān)系，其能預(yù)示癌癥的進(jìn)展。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，交通越來(lái)越發(fā)達(dá)，也顯著增加了交通事故發(fā)生率，研究顯示[3]，嚴(yán)重創(chuàng)傷后，機(jī)體常出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)及免疫紊亂，是導(dǎo)致患繼發(fā)感染及膿毒癥的主要原因。但目前尚沒有研究報(bào)道Th1/Th2和Th17/Treg平衡變化與膿毒癥的關(guān)系，基于此本研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年1月至2019年1月收治的68例多發(fā)傷患者，根據(jù)是否出現(xiàn)膿毒癥分為2組，無(wú)膿毒癥組43例，其中男33例，女10例；年齡17～68歲，平均(35.54±2.64)歲；受傷原因：2例毆擊，4例擠壓，6例銳器刺入，7例高處墜落，24例交通事故；創(chuàng)傷嚴(yán)重程度(injury severe score，ISS)評(píng)分17～47分，平均(35.54±2.64)分。膿毒癥組25例，其中男19例，女6例；年齡18～67歲，平均(35.71±2.25)歲；受傷原因：1例毆擊，2例擠壓，3例銳器刺入，4例高處墜落，15例交通事故；ISS評(píng)分16～50分，平均(36.66±2.72)分。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)膿毒癥診斷符合《中國(guó)膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[4]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；(2)受傷前1個(gè)月內(nèi)無(wú)感染性疾病者；(3)患者及家屬均知情研究；(4)受傷指入院時(shí)間<24 h；(5)ISS評(píng)分≥16分。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠及哺乳期婦女；(2)長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素者；(3)慢性疾病者；(4)免疫性疾病者；(5)年齡<14歲者。另選取同時(shí)期來(lái)我院體檢健康者50例為對(duì)照組，其中男39例，女11例；年齡18～65歲，平均(35.28±2.39)歲；3組研究對(duì)象年齡、性別構(gòu)成及兩組患者ISS評(píng)分無(wú)差異(P>0.05)。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 指標(biāo)檢測(cè)

主要試劑：PE anti-human IL-17A、647 anti-human FOXP3、PE/Cy5 anti-human CD25、FITC anti- human CD4，以上抗體及同型抗體均由美國(guó)BD公司提供。收集所有研究對(duì)象入院后24 h內(nèi)9 mL外周血，分為3份，各3 mL。第1份促凝：3000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃環(huán)境下待檢，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)血清IFN-γ、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TCF-β)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素17(IL-17)、白介素23(IL-23)水平，試劑盒均由艾美捷科技有限公司提供，所有操作嚴(yán)格試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；第2份給予肝素鋰抗凝：淋巴細(xì)胞分離后，采用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)檢測(cè)CD4+、CD25+Foxp3+Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和Thl7轉(zhuǎn)錄因子RORγr mRNA水平，Trizol一步法提取總RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄cDNA，RT-PCR檢測(cè)RORγr、Foxp3 mRNA水平，人Foxp3上、下游引物：5’-TGACCAAGGCTTCATCTGTG-3’、5’-GAGGA ACTCTGGGAATGTGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：179 bp；人RORγr上、下游引物：5’-CCTGGGCTCCTCCCCTCACC-3’、5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTFGCC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：170 bp；人β-actin上、下游引物：5’-AGCGAGCATCCCCCA AAGTT-3’、5’-GGGCACGA AGGCTCATCATF-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：284 bp；引物均東莞太力生物工程有限公司合成；第3份肝素鋰抗凝：淋巴細(xì)胞分離后，采用流式細(xì)胞術(shù)(ECM)檢測(cè)CD4+、CD25+、Th1、Th2、Th17、Treg數(shù)量及比值，所有試驗(yàn)步驟均根據(jù)說(shuō)明書和Carrier Y等試驗(yàn)進(jìn)行，使用BD FACSDiva軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 病情嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)

膿毒癥患者入院后使用膿毒癥相關(guān)序貫器官衰竭評(píng)估(sepsis-related organ failure assessment，SOFA)病情嚴(yán)重程度，包括呼吸、血液、肝臟、循環(huán)、神經(jīng)、腎臟6個(gè)項(xiàng)目，總分值0～44分，得分越高病情越嚴(yán)重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 3組外周血Th1、Th2、Th17、Treg數(shù)量及比值對(duì)比

膿毒癥組外周血Th2、Th17、Treg、Th17/Treg比值明顯高于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組，Th1和Th1/Th2比值明顯低于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組(P<0.05)；無(wú)膿毒癥組外周血Th2、Treg、Th17/Treg比值明顯高于對(duì)照組，Th1和Th1/Th2比值明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，Th17與對(duì)照組對(duì)比無(wú)差異(P>0.05)，見表1。

表1 3組外周血Th1、Th2、Th17、Treg數(shù)量及比值對(duì)比

2.2 3組外周血相關(guān)因子mRNA水平對(duì)比

膿毒癥組Foxp3和RORγr mRNA水平明顯高于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組，無(wú)膿毒癥組Foxp3和RORγr mRNA水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 3組外周血相關(guān)因子mRNA水平對(duì)比

2.3 3組外周血Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞因子含量對(duì)比

膿毒癥組外周血IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23水平明顯高于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組，IFN-γ水平明顯低于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組(P<0.05)；無(wú)膿毒癥組IL-6、IL-10水平明顯高于對(duì)照組，IFN-γ水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；膿毒癥組與無(wú)膿毒癥組TCF-β水平對(duì)比無(wú)差異(P>0.05)，均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；無(wú)膿毒癥組與對(duì)照組IL-4、IL-17、IL-23水平對(duì)比無(wú)差異(P>0.05)，見表3。

表3 3組外周血Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞因子含量對(duì)比

2.4 膿毒癥組SOFA評(píng)分與外周血Th1、Th2、Th17、Treg數(shù)量的相關(guān)性

膿毒癥組SOFA評(píng)分為(12.76±2.89)分，Pearson相關(guān)性分析顯示，膿毒癥組SOFA評(píng)分與外周血Th1呈負(fù)相關(guān)，與Th2、Th17、Treg呈正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 膿毒癥組SOFA評(píng)分與外周血Th1、Th2、Th17、Treg數(shù)量的相關(guān)性

3 討 論

CD4+T細(xì)胞為人體免疫系統(tǒng)重要細(xì)胞，在不同細(xì)胞因子作用下，Th細(xì)胞前體(Th0)可分化為不同細(xì)胞亞群，包括Th1、Th2、Th17、Treg等，最早由李呼倫教授于2009年提出Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞亞群功能失衡，且隨著研究的深入，大量試驗(yàn)證實(shí)，各亞群可分泌具備各自功能的細(xì)胞因子，并能互相進(jìn)行影響制約[5]。研究表明[6]，Th1細(xì)胞可分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，介導(dǎo)并激活巨噬和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，對(duì)B細(xì)胞功能進(jìn)行抑制。Th2細(xì)胞可分泌IL-4、IL-10等多種細(xì)胞因子，研究顯示[7]，其能激活B細(xì)胞，并分化產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。鐘興明等[8]在多囊卵巢綜合征患者研究中發(fā)現(xiàn)，患者存在Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ低表達(dá)，Th2細(xì)胞因子IL-6、IL-10高表達(dá)，導(dǎo)致Th1向Th2飄移，抑制細(xì)胞免疫。Tong等[9]研究也證實(shí)，Th1細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答可對(duì)腫瘤增生進(jìn)行抑制，因此若Th2細(xì)胞過度表達(dá)，使Th1處于劣勢(shì)，則會(huì)抑制細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步發(fā)展。結(jié)果顯示，膿毒癥組外周血Th2明顯高于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組，Th1、Th1/Th2明顯低于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組，無(wú)膿毒癥組外周血Th2明顯高于對(duì)照組，Th1和Th1/Th2比值明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明Th1和Th2參與了炎癥反應(yīng)，且結(jié)果顯示，膿毒癥組外周血IL-4、IL-6、IL-10水平明顯高于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組，IFN-γ水平明顯低于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組，無(wú)膿毒癥組IL-6、IL-10水平明顯高于對(duì)照組，IFN-γ水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；膿毒癥組與無(wú)膿毒癥組TCF-β水平對(duì)比無(wú)差異，均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；無(wú)膿毒癥組與對(duì)照組IL-4水平對(duì)比無(wú)差異(P>0.05)，說(shuō)明膿毒癥組和無(wú)膿毒癥組均存在Th1向Th2漂移的現(xiàn)象，且膿毒癥組表現(xiàn)明顯，由此提示膿毒癥和引起強(qiáng)烈免疫抑制。

Treg具有免疫無(wú)能性和免疫抑制性特征，在機(jī)體免疫維持中扮演重要角色，其中Foxp3為控制Treg細(xì)胞功能和分化的重要基因，可通過釋放TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞增殖活化，以維持自身免疫耐受[10-11]。Th17主要功能為募集活化中性粒細(xì)胞，可分泌TNF-α、IL-17等細(xì)胞因子，在多種炎癥反應(yīng)和免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，與Treg細(xì)胞分化間呈相互影響，功能上相互拮抗，共同維持機(jī)體免疫狀態(tài)，使機(jī)體處于免疫平衡狀態(tài)[12-13]。研究顯示，膿毒癥發(fā)生后機(jī)體處于代償性防疫狀態(tài)，即Treg與Th17細(xì)胞百分比均有所提升，但以Treg細(xì)胞為主，隨著病情加重，機(jī)體又會(huì)處于免疫抑制狀態(tài)，也會(huì)同時(shí)增加Treg與Th17細(xì)胞百分比，但主要以Th17細(xì)胞為主，均提示膿毒癥患者Th17/Treg處于失衡狀態(tài)[14]。結(jié)果顯示，膿毒癥組外周血Th17、Treg、Th17/Treg比值、IL-17水平、Foxp3和RORγr mRNA水平明顯高于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組，無(wú)膿毒癥組外周血Treg、Th17/Treg比值、Foxp3和RORγr mRNA水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，無(wú)膿毒癥組與對(duì)照組IL-17水平對(duì)比無(wú)差異(P>0.05)，說(shuō)明Th17和Treg也參與了炎癥反應(yīng)。IL-23為維持Th17功能重要細(xì)胞因子，當(dāng)缺乏IL-23參與，則會(huì)顯著降低IL-17水平[15]。結(jié)果顯示，膿毒癥組外周血IL-23水平明顯高于無(wú)膿毒癥組和對(duì)照組(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)Th17參與了炎癥反應(yīng)，且存在Th17/Treg比值失衡，隨著病情的進(jìn)展，其失衡進(jìn)一步加強(qiáng)。SOFA評(píng)分是評(píng)估膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后常用評(píng)分，結(jié)果顯示，膿毒癥組SOFA評(píng)分與外周血Th1呈負(fù)相關(guān)，與Th2、Th17、Treg呈正相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明膿毒癥患者Th1/Th2和Th17/Treg比值失衡還能反映病情進(jìn)展和預(yù)后，可能作為患者膿毒癥發(fā)生和預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，膿毒癥患者外周血存在明顯Th1/Th2和Th17/Treg比值失衡，與膿毒癥發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)系。