阿托伐他汀對實驗性大鼠腦出血后神經(jīng)功能保護的研究

張嵐，賀武斌，孔亞男，鐘倩，于歡

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院；2.錦州醫(yī)科大學護理學院，遼寧 錦州 121000)

腦出血是嚴重的腦卒中疾病，患者死亡率高、預后差。臨床治療腦出血一般采取調(diào)脂、降壓、降糖、補充腦營養(yǎng)等保守治療方法，但療效和預后的改觀均不明顯[1-2]。腦水腫是腦出血患者的常見合并癥之一，也是引發(fā)神經(jīng)功能缺損、促使腦出血加重的首要因素，水通道蛋白4(AQP-4)參與腦組織細胞的水分子轉(zhuǎn)膜，與腦水腫的發(fā)生密切先關(guān)，在腦出血發(fā)生后，AQP-4的表達水平顯著增加，用以清除胞間多余水分、維持腦細胞水平衡[3-4]。阿托伐他汀是一種常用的羥甲基戊二酸單酰輔酶還原酶抑制劑，具有調(diào)脂、抗炎、修復血管內(nèi)皮和促進腦神經(jīng)新生的作用，還有研究提示阿托伐他汀能夠下調(diào)APQ-4并因此起到抗腦水腫的治療效果，為了探討阿托伐他汀對于腦出血的療效、神經(jīng)功能、腦組織形態(tài)學和腦水量的影響，進一步分析阿托伐他汀與APQ-4表達的關(guān)系和作用機制，特進行本次動物實驗。

1 資料和方法

1.1 實驗對象

選取SD大鼠共120只，雌雄各60只，由中科院動物研究所提供，體重250～300 g，在我院動物實驗中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)用飼料購自由上海帆泊生物，SD大鼠飲用水為自來水，溫度(20～25)℃，每天光照時間為12 h，飼養(yǎng)室濕度40%～80%，每日清潔飼養(yǎng)籠、更換墊料，飼養(yǎng)1 w，待大鼠適應環(huán)境后，剔除生病、死亡大鼠并進行相關(guān)動物實驗。

向大鼠腹腔注射麻醉藥物，向顱內(nèi)注射自體血構(gòu)建腦出血SD大鼠模型，從存活大鼠中以腦出血動物行為學分級結(jié)果選擇腦出血分級1～3級SD大鼠，根據(jù)性別分層隨機抽樣選擇80只SD大鼠(雌雄各半)作為造模成功的最終實驗對象。將80只SD大鼠隨機分為治療組和對照組，每組40只，治療組給予10 mg/kg阿托伐他汀進行灌胃治療，對照組注射等量無菌生理鹽水，兩組以給藥前24 h、給藥后96 h作為觀察點分配SD大鼠，見表1。

表1 兩組不同觀察點的SD大鼠分配情況統(tǒng)計(只)

1.2 試劑和儀器

試劑：3.5%水合氯醛(武漢博萊特化工)、阿托伐他汀鈣片(國藥準字：H20051407；生產(chǎn)廠家：輝瑞制藥有限公司；規(guī)格：10 mg×7 s)、AQP-4 Elisa檢測試劑盒(臻科生物)、蘇木精伊紅染色液(廣州藝得諾生物科技有限公司)；PBS溶液、二甲苯、0.9%生理鹽水、梯度酒精、3%H2O2、甲醛溶液均在我院病理科配制。

儀器：2CA-320M數(shù)字攝像生物顯微鏡(上海光學儀器廠)、BS210S電子天平(德國賽多利斯)、微量溶液進樣器(北京英偉達科技有限公司)、恒溫干燥箱(上海精若科學儀器有限公司)、鼠腦立體定位儀(西南醫(yī)科大學中心實驗室)、Image-Pro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)、相關(guān)手術(shù)器械由我院提供。

1.3 方法

1.3.1 腦出血SD大鼠造模手術(shù) 本研究采用自體血顱內(nèi)注入術(shù)制作腦出血SD大鼠模型，用于造模的120只大鼠在術(shù)前均禁飲食8 h以上，稱重后向大鼠腹腔注射0.01 mL/g劑量的3.5%水合氯醛進行麻醉，麻醉完全后，取仰臥位，大鼠頭顱置于鼠腦立體定位儀，固定大鼠牙齒、耳道，使其前囟、后囟保持正中水平。剃顱頂毛，消毒鋪巾，在兩耳連線正中行2 cm垂直切口，完全暴露顱骨，加30%雙氧水腐蝕筋膜后，在前囟前0.2 mm、前囟、后囟連線中線后3 mm以牙鉆垂直小心地鉆1 mm圓孔，至硬腦膜前停止。用40 ℃溫水浸泡大鼠尾部2 min，待變軟后拭干，酒精表面消毒后斷尾取血50 μL，利用微量進樣器沿圓孔垂直進針5～6 mm，以20 μL/min滴速注入自體鼠尾血10 μL，觀察大鼠應激情況，若無異常再用相同的方式注射完剩余40 μL自體血，注射后留針5 min，緩慢退針以免傷及腦部，約2 min完成退針。以骨蠟封鼠尾和針口，手術(shù)部位均用碘伏消毒、縫合，麻醉蘇醒前觀察大鼠生命體征，蘇醒后，從存活大鼠中以腦出血動物行為學分級結(jié)果選擇腦出血分級1～3級SD大鼠，根據(jù)性別分層隨機抽樣選擇取80只SD大鼠(雌雄各半)作為造模成功的最終實驗對象并回籠飼養(yǎng)。

1.3.2 給藥方法 在上述觀察時間點對各組實驗對象進行神經(jīng)功能評價和腦組織摘除手術(shù)后處死，治療組給予10 mg/kg阿托伐他汀灌胃，對照組注射等量無菌生理鹽水，第一次給藥后每24 h給藥1次。

1.3.3 BWC的測定 在各觀察點神經(jīng)功能評估結(jié)束后對各組大鼠進行麻醉，麻醉劑為3.5%水合氯醛，大鼠意識完全喪失后，立即離斷頭頸部，開顱并取出腦組織，仔細探查造模時注入自體血的針眼區(qū)域，以針眼為中心做縱切將腦組織分為前、后兩個部分，取前腦組織置于安瓿瓶用電子天平，通過差值法計算前腦組織濕重N1；稱重后將前腦組織置于恒溫干燥箱中以(80～100)℃溫度烘烤24 h后取出，通過差值法計算腦組織干重N2，差值=NT-N0(N0為安瓿瓶空瓶重量)。BWC=(N1-N2)/N1×100%。稱重完成后，將剩余的腦組織置于甲醛溶液中加以固定，選取針眼附近出血灶進行切片、HE染色，并對切片進行AQP-4免疫組化檢測。

1.3.4 APQ-4表達免疫組化檢測 將剩余腦組織制成石蠟切片后送至病理科按照APQ-4 Elisa檢測試劑盒操作要求進行免疫組化檢測，首先對樣本進行脫蠟處理，并加入3%H2O2孵育20 min，用蒸餾水洗凈后置于搖床，加入PBS溶液浸泡5 min，加入封閉液山羊血清孵育5 min，吸去液體，用PBS溶液反復清洗3次，每次5 min。加入一抗兔抗鼠APQ-4，稀釋比例1∶100，37 ℃孵育30 min后用PBS溶液清洗3次，每次5 min，加入二抗辣根過氧化物酶底物，37 ℃孵育2 h后漂洗3次，每次5 min。加入顯色劑DAB，顯色后用蘇木精伊紅染液復染約10 s，后進行脫水、透明處理，封片后置于生物顯微鏡下觀察顏色并捕捉影像，染色后，APQ-4表達為陽性的細胞細胞核應呈棕褐色，隨機選取整個切片的5個視野攝像，用Image-Pro-Plus 6.0圖像分析軟件處理圖像，規(guī)定APQ-4陰性表達細胞吸光度為零，計算整體細胞的吸光度值(OD)并取平均值，OD越高，表明APQ-4陽性表達率越高。

1.4 評估標準

1.4.1 動物腦出血分級標準 在取自體血注射SD大鼠顱內(nèi)完成腦出血造模后約2 h，待大鼠蘇醒后動物行為根據(jù)動物行為學特征對大鼠的腦出血嚴重程度進行評級，標準為：0級，大鼠神經(jīng)及動作行為均正常；1級，不能靈活、完全地伸展對側(cè)前爪；2級，癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈、追尾狀；3級，爬行時向?qū)?cè)傾倒或不能走路、意識喪失。造模后選取1～3級腦出血SD大鼠，飼養(yǎng)1 w后剔除死亡大鼠，根據(jù)性別分層抽樣選取80只腦出血SD大鼠造模成功并分組實驗。

1.4.2 大鼠神經(jīng)功能缺失評分標準 在給藥前第24 h、給藥后第96 h對兩組SD大鼠的神經(jīng)功能缺失程度進行評分，采用Masao Shmi izu-Sasamata標準：(1)自主活動受限情況；(2)左前肢偏癱情況；(3)提尾時左前肢伸情況；(4)抗側(cè)推能力；(5)爬行時左傾斜度；(6)向左環(huán)行度；(7)觸須反應，根據(jù)上述條目大鼠神經(jīng)缺損程度每項計0分(正常)、1分(中等異常)、2分(嚴重異常)，神經(jīng)功能缺失評分總分0～14分，評分越高，表明大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 給藥前后兩組SD大鼠的神經(jīng)功能缺損程度分析

給藥前24 h，兩組SD大鼠的神經(jīng)功能缺損程度評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，給藥后96 h，治療組神經(jīng)功能缺損評分較給藥前顯著降低(P<0.05)，對照組神經(jīng)功能缺損評分較給藥前無顯著變化(P>0.05)，給藥后治療組SD大鼠的神經(jīng)功能缺損評分也明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 給藥前后兩組SD比較(分)

2.2 給藥前后兩組SD大鼠的BWC分析

給藥前24 h，兩組SD大鼠的BWC數(shù)值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，給藥后96 h，治療組BWC數(shù)值較給藥前顯著降低(P<0.05)，對照組BWC數(shù)值較給藥前無顯著變化(P>0.05)，給藥后治療組SD大鼠的BWC數(shù)值也明顯低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 給藥前后兩組SD大鼠的BWC數(shù)值比較

2.3 給藥前后兩組SD大鼠的APQ-4表達情況

給藥前24 h，兩組SD大鼠的APQ-4陽性表達值均高于正常水平，比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，給藥后96 h，治療組APQ-4陽性表達值均較給藥前顯著降低(P<0.05)，但給藥后治療組SD大鼠的APQ-4陽性表達值顯著低于對照組(P<0.01)，見表4，給藥前后顯微鏡下兩組SD大鼠腦組織免疫組化APQ-4表達情況，見圖1。

表4 給藥前后兩組SD大鼠的APQ-4陽性表達光密度值比較

2.4 給藥前后兩組SD大鼠的出血灶組織形態(tài)學分析

光學顯微鏡下，給藥前，兩組大鼠腦組織可見紅細胞聚集、明顯水腫伴隨炎性浸潤，出血灶面積、最大徑差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，給藥后96 h，治療組出血灶面積、炎癥浸潤均明顯減少，血腫灶組織形態(tài)學改善情況優(yōu)于對照組，見圖2。

3 討 論

腦出血是指在未出現(xiàn)腦外傷情況下腦內(nèi)血管破裂引發(fā)的顱內(nèi)出血疾病，在腦卒中患者中的發(fā)病率為20%～30%，相較于缺血性腦卒中(腦栓塞)而言，腦出血雖發(fā)病率較低，但患者在急性期的死亡率更高，可達到30%～50%[5-6]，在恢復期則有80%以上的患者伴隨神經(jīng)功能缺損和障礙。

目前，開顱手術(shù)是治療腦出血的有效手段，但開顱手術(shù)具有較高風險，因手術(shù)造成的死亡率高達30%[7]，對于老年患者一般采取調(diào)脂、降壓、降糖、補充腦營養(yǎng)等藥物治療方法[8-9]。大量動物實驗和臨床數(shù)據(jù)表明[10-12]，腦出血患者的血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)壞死后，與其相鄰的腦組織細胞和內(nèi)皮細胞的連接出現(xiàn)空隙，導致膜滲透壓改變、水分子轉(zhuǎn)膜出現(xiàn)障礙，這也使腦水腫嚴重程度與腦出血患者的預后出現(xiàn)了相關(guān)性聯(lián)系，即腦水腫面積越大，患者死亡率、致殘率越高，此外，腦水腫還能引發(fā)出血灶周邊的炎性浸潤和二次血管破裂和損傷，因此，減輕血管源性腦水腫是臨床治療腦出血的首要要求[13]。

水通道蛋白4(AQP-4)廣泛分布于腦組織、內(nèi)皮血管、蛛網(wǎng)膜下腔，參與腦組織細胞的水分子轉(zhuǎn)膜活動，具有清除胞間多余水分、維持腦細胞水平衡的重要作用，在腦出血時，AQP-4的表達出現(xiàn)顯著上調(diào)，且其表達水平與腦出血嚴重程度具有高度相關(guān)性，即出血灶越大、水腫面積越大，APQ-4表達水平越高。阿托伐他汀作為羥甲基戊二酸單酰輔酶還原酶抑制劑，具有抑制膽固醇合成、抗自由基氧化、抗炎、促進神經(jīng)功能修復等作用[14]，本文以腦出血SD大鼠模型為研究對象，通過分組給藥、比較不同觀察點大鼠的神經(jīng)功能缺損程度、出血灶四周組織形態(tài)學特點、BWC和AQP-4表達水平，探討了阿托伐他汀在消除腦水腫、重建腦組織神經(jīng)功能方面的積極作用，也試分析了阿托伐他汀對APQ-4代謝表達的調(diào)控關(guān)系和可能作用機制。

涂鄂文等的動物實驗[15]結(jié)果提示，10 mg/kg劑量的阿托伐他汀對腦出血大鼠的神經(jīng)功能的保護作用、腦水腫及出血灶組織形態(tài)學的改善水平最優(yōu)，本研究也采用該劑量進行給藥。研究結(jié)果與涂鄂文等的研究結(jié)果具有一致性：即對腦出血SD大鼠模型給予阿托伐他汀可顯著改善大鼠神經(jīng)功能缺失水平、減輕BWC及腦水腫、減少出血灶和炎性浸潤灶，這也與阿托伐他汀能夠下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、AQP-4表達水平，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)表達水平有關(guān)。此外，本研究還著重探討了阿托伐他汀對AQP-4表達的影響，研究結(jié)果顯示，給藥后96 h，與給藥前相比，治療組大鼠腦組織切片中的AQP-4陽性表達光度值顯著降低，同時少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)分析，阿托伐他汀可能參與腦組織水分子轉(zhuǎn)膜過程的下述途徑：(1)平衡膠質(zhì)細胞參與的鈉鉀泵，疏通水分子通道、緩解腦水腫、消除血腦屏障；(2)抑制蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化作用，保護腦組織神經(jīng)功能；(3)抑制細胞膜去極化造成的鈣超載，減輕血管內(nèi)皮再灌注損傷。

綜上所述，將阿托伐他汀應用于實驗性大鼠的腦出血模型的治療中對于大鼠神經(jīng)缺損情況、腦水腫、出血灶面積和AQP-4的表達均具有明顯的改善作用，值得進一步進行臨床試驗研究。