SR9009對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G細(xì)胞作用的研究

馬辰，王堃，馬云勝，單偉

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2.盤(pán)錦市中心醫(yī)院急診科，遼寧 盤(pán)錦 124000)

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是以膠質(zhì)樣腫瘤細(xì)胞異常增殖生長(zhǎng)為特征的最具侵襲性的人類(lèi)腦腫瘤之一。目前已知生物節(jié)律的改變常常會(huì)導(dǎo)致多種病理情況出現(xiàn)，研究表明機(jī)體晝夜節(jié)律紊亂是增加患癌癥和代謝紊亂疾病的風(fēng)險(xiǎn)之一[1]。雖然人們對(duì)腫瘤固有的晝夜節(jié)律功能知之甚少，但是通過(guò)對(duì)一些與生物節(jié)律有關(guān)成分的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)這些成分有可能為癌癥的預(yù)防和治療提供新的選擇[2]。人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G細(xì)胞就是作為研究腫瘤細(xì)胞固有生物節(jié)律的一個(gè)癌細(xì)胞模型。

吡咯衍生物SR9009是一種特異性REV-ERB激動(dòng)劑，近年來(lái)對(duì)其生物學(xué)特性以及靶向治療生物晝夜節(jié)律紊亂(比如肥胖、血脂異常、葡萄糖耐受不良、睡眠障礙和癌癥)研究發(fā)現(xiàn)：其對(duì)生物晝夜節(jié)律的藥理學(xué)調(diào)節(jié)主要是通過(guò)抑制細(xì)胞中異常激活的通路從而影響細(xì)胞的生存能力。研究表明激活REV-ERB受體激動(dòng)劑SR9009，對(duì)小鼠體內(nèi)代謝同樣產(chǎn)生了影響：如在不改變動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)量或食物攝入量條件下的食源性肥胖鼠的體重減輕[3]?？紤]到REV-ERBs對(duì)脂質(zhì)、葡萄糖和能量代謝調(diào)節(jié)的作用以及癌細(xì)胞的高代謝需求，我們?nèi)藶椋簩?duì)生物節(jié)律成分——REV-ERB的藥理學(xué)調(diào)節(jié)可能會(huì)改變癌細(xì)胞生存的代謝途徑。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用SR9009處理對(duì)T98G細(xì)胞，并將其與BOR對(duì)照治療進(jìn)行比較，評(píng)估其對(duì)腫瘤細(xì)胞生存能力的影響，同時(shí)觀察在模擬使用地塞米松(dexamethasone，DEX)后不同時(shí)間段的藥物敏感反應(yīng)期，以及觀察其對(duì)細(xì)胞代謝水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G細(xì)胞株，購(gòu)置于上海細(xì)胞庫(kù)。所有實(shí)驗(yàn)操作符合錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并符合相關(guān)要求。SR9009，BOR購(gòu)于深圳華萊生物科技公司；DMEM，F(xiàn)BS購(gòu)于Gibco公司；兔抗谷氨酰胺合成酶，兔抗GFAP，兔抗REV-ERBα，GFP/CY3二抗試劑盒、MTT(噻唑藍(lán))檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京博奧森公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，采用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清(FBS)，于37 ℃，5% CO2和飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天換液1次，待細(xì)胞融合后進(jìn)行消化傳代。應(yīng)用恢復(fù)活力的第二代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測(cè)定SR9009對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響

第二代T98G細(xì)胞以1×104密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃下過(guò)夜。次日，培養(yǎng)的細(xì)胞分別與DMSO和10、20、40 μM 下REV-ERB激動(dòng)劑SR9009共同孵育，孵育時(shí)間分別為24、48、72 h。孵育后，向每個(gè)孔中加入10 μL二苯基四唑溴化銨(MTT，5 mg/mL)，37 ℃ 孵育2 h。然后，向每個(gè)孔中加入100 μL DMSO-異丙醇(1∶1)混合液，在室溫下避光孵育10 min。樣品以650 nm波長(zhǎng)激發(fā)，在570 nm波長(zhǎng)下用的微孔板酶標(biāo)儀進(jìn)行分析。將DMSO處理細(xì)胞活力設(shè)定為100%。

1.4 SR9009對(duì)T98G細(xì)胞活力的時(shí)間影響效應(yīng)觀察

T98G細(xì)胞以1×104密度接種于96孔板中，在37 ℃，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。次日，向每孔內(nèi)添加100 nM 地塞米松后與細(xì)胞培養(yǎng)20 min，然后以每6個(gè)孔為1個(gè)單位，分別按照每6個(gè)小時(shí)間隔(0、6、12、18、24、30、36 h)，依次添加20 μM的SR9009或500 nM的BOR進(jìn)行孵育。最后，按照前面所述方法，用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，在570 nm處用微孔板酶標(biāo)儀進(jìn)行對(duì)照分析。同樣以DMSO處理的細(xì)胞活力作為100%。

1.5 SR9009對(duì)T98G細(xì)胞周期影響的分析

T98G細(xì)胞分別與DMSO和SR9009(20 μM) 在無(wú)血清DMEM中孵育后36 h。然后，去除培養(yǎng)基，向DMEM培養(yǎng)基內(nèi)添加20%FBS，繼續(xù)應(yīng)用DMSO或SR9009孵育細(xì)胞16 h。最后，胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，冷PBS洗滌，在20 ℃下用70% 乙醇固定24 h。細(xì)胞重懸于150 mL含50 mg/mL碘化丙啶和10 mg RNAse A的PBS染色液中。分別取5×104個(gè)細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SR9009或BOR單獨(dú)用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響

20 μM SR9009和500 nM BOR 分別與T98G細(xì)胞孵育48 h和24 h，同時(shí)用40 μM SR9009與HepG2細(xì)胞孵育48 h。然后去除培養(yǎng)基，用冷PBS 洗滌細(xì)胞，胰酶消化并收集細(xì)胞。細(xì)胞與2 μM濃度活細(xì)胞熒光示蹤探針二乙酸熒光素(FDA)在37 ℃下孵育40 min，PBS洗滌2次，樣本在485 nm波長(zhǎng)光激發(fā)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)530 nm處的熒光強(qiáng)度。陰性對(duì)照為無(wú)熒光指示劑的細(xì)胞，用50 mg/mL碘化丙鈉染色鑒別活細(xì)胞。使用Flow Jo軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.7 藥物聯(lián)合處理對(duì)T98G細(xì)胞的協(xié)同作用觀察

在37 ℃下將T98G細(xì)胞置于含100 nM 地塞米松和5% FBS的DMEM培養(yǎng)基中預(yù)孵育20 min。然后采用以下單獨(dú)或聯(lián)合不同濃度藥物與細(xì)胞共孵育：(1)單獨(dú)SR9009低(10 μM)和高劑量組(20 μM)；(2)單獨(dú)BOR低(50 nM)和高劑量組(500 nM)；(3)聯(lián)合BOR(50 nM)+SR9009(10 μM)低劑量組；(4)聯(lián)合高劑量組BOR(500 nM)+SR9009(20 μM)。然后37 ℃孵育36 h。MTT法分析細(xì)胞活力。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

培養(yǎng)細(xì)胞的蓋玻片在含4%多聚甲醛PBS中固定15 min，PBS沖洗2次，用封閉緩沖液(PBS中加入0.1% 牛血清白蛋白、0.1% 吐溫20和0.1% 甘氨酸)處理10 min，分別滴加一抗(兔抗谷氨酰胺合成酶、波形蛋白、GFAP、REV-ERBα)，并在4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。次日，取出蓋玻片并洗滌3次，與CY3或GFP標(biāo)記的抗兔免疫球蛋白(IgG，1∶500)室溫孵育1 h。DAPI染色細(xì)胞核，沖洗蓋玻片，梯度酒精脫水，封片，共聚焦顯微鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 SR9009對(duì)T98G細(xì)胞活力和形態(tài)的影響

免疫細(xì)胞化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)：人T98G細(xì)胞表達(dá)了波形蛋白(Vimentin)、谷氨酰胺合成酶(GS)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)這些典型的膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物以及生物鐘成分蛋白R(shí)EV-ERBa，見(jiàn)圖1A～圖D。此外，與DMSO對(duì)照組相比，細(xì)胞與不同濃度(10、20、40 μM)SR9009在不同時(shí)間(24、48、72 h)處理后，隨著藥物濃度增加和孵育時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞形態(tài)受到了顯著影響，可見(jiàn)細(xì)胞體積萎縮變小，胞核和胞質(zhì)均減小，尤其是胞質(zhì)減少明顯，見(jiàn)圖1E～圖1F。MTT法顯示濃度為10 μM的SR9009處理的T98G細(xì)胞活力與20 μM或40 μM處理的細(xì)胞活力差異明顯；而SR9009處理24 h與處理48、72 h的細(xì)胞活力也不同。在20、40 μM 濃度分別孵育48、72 h的時(shí)候細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)表1、圖2。尤其是與20、40 μM的SR9009孵育72 h后，有活性細(xì)胞僅剩下約20%左右。

A:綠色為T(mén)98G細(xì)胞表達(dá)的波形蛋白；B：綠色為T(mén)98G細(xì)胞表達(dá)的谷氨酰胺合成酶；C：T98G細(xì)胞與DMSO孵育48 h，紅色熒光為GFAP表達(dá)；D：T98G細(xì)胞與DMSO孵育48 h，REV-ERBa 呈綠色熒光；E：T98G細(xì)胞與SR9009 孵育48 h，GFAP呈紅色熒光；F：T98G細(xì)胞與SR9009孵育48 h，REV-ERBa呈綠色熒光。標(biāo)尺：10 μm；VIMENTIN：波形蛋白；GFAP：膠質(zhì)原纖維酸性蛋白；GS：谷氨酰胺合成酶

表1 MTT法測(cè)試SR9009對(duì)T98G細(xì)胞活力的影響

SR9009濃度和處理時(shí)間對(duì)T98G細(xì)胞活力均有顯著差異；◇P<0.01；與24 h組比較，△P<0.01；與48 h比較，☆P<0.01，n=6

2.2 SR9009、BOR處理時(shí)間對(duì)T98G細(xì)胞活力的影響

MTT法分析SR9009(20 μM)處理不同的時(shí)間對(duì)T98G細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示出明顯的藥物處理時(shí)間效應(yīng)。T98G細(xì)胞活力水平隨藥物處理時(shí)間變化而變化，孵育6 h與孵育18、24、30 h有顯著差異。即在SR9009處理18～30 h時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞活力為最低水平，在該時(shí)間段內(nèi)藥物對(duì)細(xì)胞活力的影響也最明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。和SR9009相似，使用BOR(500 nM)處理的T98G細(xì)胞同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力存在顯著的時(shí)間效應(yīng)。與6 h相比，在共孵育后的12～24 h時(shí)間段內(nèi)細(xì)胞活力為最低(P<0.01)，見(jiàn)圖3B。

2.3 SR9009對(duì)T98G細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，經(jīng)20% FBS刺激，SR9009處理后的T98G細(xì)胞58.2%處于G0/G1期，而DMSO處理后的細(xì)胞只有43.3% 處于G0/G1期(P<0.01)。相反，經(jīng)DMSO處理的細(xì)胞中，S期細(xì)胞比例為40.1%，遠(yuǎn)高于經(jīng)SR9009處理的細(xì)胞的22.6%(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.4 SR9009對(duì)T98G細(xì)胞氧化還原和脂質(zhì)代謝的影響

用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量熒光強(qiáng)度顯示：與DMSO對(duì)照組相比，20 μM 濃度SR9009處理的T98G細(xì)胞ROS水平顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖5A。相反，與DMSO對(duì)照組細(xì)胞相比，與500 nM濃度的BOR孵育24 h的T98G細(xì)胞中ROS水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5B。

A：MTT法檢測(cè)不同時(shí)間添加20 μM濃度的SR9009與地塞米松(100 nM)共同處理的T98G細(xì)胞后不同時(shí)間段的細(xì)胞活力；B：MTT法測(cè)定BOR(500 nM)和地塞米松處理的T98G細(xì)胞在不同時(shí)間段的細(xì)胞活力，*P<0.05，#P<0.01，n=6。BOR=硼替佐米

A：DMSO處理組細(xì)胞周期；B：SR9009處理組細(xì)胞周期圖；C：DMSO和SR9009處理對(duì)T98G細(xì)胞周期影響統(tǒng)計(jì)圖。SR9009組在G0/G1期比例更高，G0/G1 *P<0.01；S *P<0.05，n=6

A:使用SR9009(20 μM，48 h) 處理T98G細(xì)胞；B：使用BOR(500 nM，24 h)處理T98G細(xì)胞。SR9009、BOR與DMSO處理的細(xì)胞相比有顯著性差異，**P<0.01，*P<0.05，n=6

2.5 SR9009和BOR聯(lián)合應(yīng)用對(duì)T98G細(xì)胞協(xié)同作用結(jié)果

通過(guò)MTT測(cè)定細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)：當(dāng)單獨(dú)給予低濃度BOR(50 nM)或SR9009(10 μM)處理時(shí)，細(xì)胞存活率仍能達(dá)到60%；然而，與每種藥物單獨(dú)處理相比，低濃度聯(lián)合(BOR 50 nM +SR9009 10 μM)處理后，細(xì)胞活力下降到28%(P<0.01)，見(jiàn)圖6A。此外，當(dāng)單獨(dú)給予高濃度BOR(500 nM)或SR9009(20 μM)藥物處理后，細(xì)胞存活率分別為28%和34%。然而，當(dāng)兩種藥物同時(shí)聯(lián)合以高劑量(BOR 500 nM+SR9009 20 μM)應(yīng)用于T98G細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞活力下降到17%(P<0.001)，見(jiàn)圖6B。可見(jiàn)兩種藥物聯(lián)合具有重要的協(xié)同增效作用。

與單獨(dú)藥物處理的細(xì)胞相比：**P<0.01，***P<0.001，n=6

3 討 論

現(xiàn)代人的一些生活習(xí)慣—如輪班、時(shí)差等可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體晝夜節(jié)律紊亂，從而增加患癌癥和代謝紊亂疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。雖然人們對(duì)腫瘤固有的晝夜節(jié)律功能知之甚少，但是通過(guò)對(duì)一些與生物節(jié)律有關(guān)成分的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)這些成分有可能預(yù)防和治療癌癥。REV-ERBs是血紅素結(jié)合的生物節(jié)律蛋白成分，它是腫瘤發(fā)生過(guò)程(如新陳代謝、增殖和炎癥)的抑制因子[5]。SR9009作為REV-ERBs特異性的激動(dòng)劑，是一種合成的吡咯衍生物。在對(duì)小鼠的初步試驗(yàn)表明，它可以使肌肉和新陳代謝率增加，運(yùn)動(dòng)時(shí)耐力增強(qiáng)。此外，它還可以降低膽固醇，減少炎癥和焦慮[6]。

本研究表明，SR9009對(duì)腫瘤固有生物節(jié)律蛋白成分的調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤細(xì)胞的代謝具有重大影響，它對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生了一定的細(xì)胞毒性作用。這些觀察結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞特定的生物節(jié)律鐘成分(如調(diào)節(jié)REV-ERBs代謝)可以發(fā)揮明顯的抗腫瘤治療作用。SR9009通過(guò)減少ROS生成改變了膠質(zhì)細(xì)胞典型的形態(tài)、細(xì)胞生存能力和新陳代謝水平。本研究中發(fā)現(xiàn)與SR9009的聯(lián)合治療進(jìn)一步增強(qiáng)了BOR的作用效果。然而，我們也發(fā)現(xiàn)這兩種藥物發(fā)揮抗腫瘤的作用機(jī)制似乎不同，BOR抑制蛋白酶體功能，而SR9009作用于與生物節(jié)律鐘相關(guān)的細(xì)胞代謝功能。同時(shí)，這兩種藥物都表現(xiàn)出具有一個(gè)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生藥物治療最高敏感性的作用時(shí)間段，即從12～18 h到24 h。

本研究結(jié)果表明，REV-ERB激動(dòng)劑明顯影響了細(xì)胞周期，因?yàn)榕cDMSO對(duì)照組細(xì)胞相比，SR9009處理的細(xì)胞中約有60%處于G0/G1期。我們探討了聯(lián)合治療是否能改善或增強(qiáng)治療效果。為此，本實(shí)驗(yàn)采用了BOR(50 nM或500 nM)，SR9009(10 nM或20 μM)單獨(dú)處理T98G細(xì)胞，以及低濃度(50 nM BOR+10 μM SR9009)和高濃度組合(500 nM BOR+20 μM SR9009)孵育T98G細(xì)胞36 h，通過(guò)MTT測(cè)定細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn)了兩種藥物具有良好的協(xié)同作用，因此在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間階段采用兩種藥劑的聯(lián)合治療可以實(shí)現(xiàn)以較低的單獨(dú)劑量獲得更好的療效[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)BOR和SR9009這兩種藥物影響氧化還原狀態(tài)的機(jī)制似乎不同，因?yàn)檠芯恐邪l(fā)現(xiàn)BOR誘導(dǎo)ROS水平升高，而SR9009處理后細(xì)胞中ROS水平下降。盡管BOR抑制蛋白酶體后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等后續(xù)機(jī)制尚不清楚。此外，在結(jié)直腸癌和人H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞以及人白血病細(xì)胞中也觀察到BOR處理后的細(xì)胞中ROS水平升高[8-9]。相反，SR9009處理的細(xì)胞與未處理的細(xì)胞相比，兩種腫瘤細(xì)胞系的ROS水平都降低。這些結(jié)果與Sulli等人提出的觀點(diǎn)一致，即癌細(xì)胞對(duì)SR9009治療的敏感性增強(qiáng)與ROS的生成增加無(wú)關(guān)[10]。