PDS5A在胰腺癌中的表達及預后的生物信息學分析

徐明昊，王圓圓，荊雨，孫翠翠，王慶軍

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

胰腺癌是死亡率很高的惡性腫瘤，位列癌癥相關死因的第4位，以及消化系統(tǒng)癌癥相關死因的第2位。手術(shù)切除是唯一有可能治愈的手段，但由于患者就診時多處于疾病相對進展或多發(fā)轉(zhuǎn)移階段，僅15%～20%的患者適合行胰腺切除術(shù)。此外，即使是完全切除后，預后也很差。切緣陰性(R0)胰十二指腸切除術(shù)后，淋巴結(jié)陰性者的5年生存率約為30%，淋巴結(jié)陽性者為10%[1]。因此，尋找胰腺癌相關特異性基因?qū)τ谝认侔┰缙诤Y查具有重要臨床意義。粘連蛋白(cohesins)是連接兩個染色體拷貝(姐妹染色體)之間的一種蛋白質(zhì)復合物，其可以確保姐妹染色單體在細胞分裂的時候被均等分配到了子代細胞中。

早期姐妹染色單體解離蛋白(PDS5)是和粘連蛋白相關的一種蛋白質(zhì)，可以沿著不同的染色體區(qū)域與粘連蛋白結(jié)合；在脊椎動物中有兩種PDS5形式：PDSA和PDSB。研究顯示PDS5A與細胞周期相關，可促進G2/M期細胞增殖，機制可能是通過與p63的相互作用促進細胞周期進而導致腫瘤進展[2]。PDS5A是一種核蛋白，在細胞中姊妹染色單體的建立、維持起重要作用。在乳腺癌、腎癌、食管癌、胃癌、肝癌和結(jié)腸癌及惡性膠質(zhì)瘤中觀察到PDS5A表達水平的改變[3]。但其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體機制尚不明確。本研究通過應用GEPIA分析來自TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx項目的所有惡性腫瘤患者數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)PDS5A在胰腺癌表達與患者的預后具有相關性。因此我們在本研究分析其在胰腺癌中的表達及其與分期、預后的關系。

1 資料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫下載基因表達數(shù)據(jù)

用于篩選患者差異基因的數(shù)據(jù)下載自TCGA數(shù)據(jù)庫的RNA-seq數(shù)據(jù)。項目名稱為“pancreatic adenocarcinoma，PAAD”。用平臺文件中的探針I(yè)D將下載的資料轉(zhuǎn)化為Gene symbol，得到標準基因名稱的矩陣。

1.2 GEPIA 分析基因表達及與分期及預后的關系

在GEPIA2的搜索框中輸入目標基因名稱“PDS5A”，在分析工具欄里選擇“profile”，輸入基因名稱“PDS5A”，分析其在所有腫瘤中的表達情況。分析工具欄里選擇“BOXBAR”，添加所有腫瘤類型，logFC臨界值設為1，P值設為0.05，對比分析并篩選PDS5A基因在正常及腫瘤組織間有統(tǒng)計學差異表達的腫瘤類型。分析工具欄里選擇“stage BAR”，腫瘤類型為“pancreatic adenocarcinoma，PAAD”，分析PDS5A基因與胰腺癌分期的關系。分析工具欄里選擇“multiple Survival Plots”，輸入基因名稱“PDS5A”，分組方式選“Quartile”，選擇所有腫瘤。分析PDS5A在所有腫瘤中與生存(OS，DFS)的相關性。

1.3 篩選差異基因及GO富集

對下載的基因表達數(shù)據(jù)以PDS5A表達的中位值為分界，分為PDS5A低表達及高表達組。應用limma R語言包篩選差異基因，其中Fdr臨界值設為0.05，logFC臨界值設為1，篩選后的差異基因進行GO富集。

1.4 材料與試劑

PCNA-1(人胰腺癌細胞)、BON-1(人胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤細胞)、HPDE6-C7(胰腺導管上皮細胞)購于中科院上海生命科學研究院。鼠抗人多克隆PDS5A抗體購于Abnova公司，鼠抗人單克隆 GAPDH 抗體購于北京中杉金橋公司。

1.5 Western blot

取細胞株行預處理后加入RIPA裂解液，提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。于10%的SDS-PAGE中電泳，電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，用一抗 PDS5A(抗體終濃度均為 1∶500)進行4 ℃孵育過夜。后用以辣根過氧化物酶標記的相應二抗(稀釋度 1∶1500)室溫孵育1.5 h，TBST 洗滌后用發(fā)光顯色并拍照。以 GAPDH(稀釋度 1∶1500)作為內(nèi)參對照。

1.6 統(tǒng)計學方法

PDS5A基因及其異構(gòu)體的表達與預后的關系應用Kaplan-Meier法計算，兩組間生存率比較采用Log-rank檢驗，P<0.05代表有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDSA在不同類型腫瘤中的表達情況

應用 GEPIA分析來自TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx項目中各種腫瘤的腫瘤組織及正常組織中PDS5A表達情況。在TCGA數(shù)據(jù)庫中我們觀察PDS5A在腫瘤組織及正常組織中表達情況，見圖1A。進一步可以發(fā)現(xiàn)在膽管癌(cholangiocarcinoma，CHOL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large b-cell lymphoma，DLBC)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)、胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)、胸腺瘤(thymoma，THYM)中PDS5A高表達，差異有統(tǒng)計學意義，見圖1B。

A：PDS5A在腫瘤組織與正常組織的表達水平；B：PDS5A在腫瘤組織中高表達且具有統(tǒng)計意義的腫瘤，*表示P<0.05

2.2 PDS5A表達與腫瘤預后的關系分析

應用 GEPIA2分析來自TCGA數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤的PDS5A表達情況與生存的相關性。我們在250例PAAD數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)PDS5A高表達與總生存 (overall survival，OS)具有負相關性，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05，見圖2A。與無病生存期(disease-free survival，DFS)差異無相關性，見圖2B。

A：PDS5A表達與胰腺癌OS的相關性；B：PDS5A表達與胰腺癌DFS的相關性

2.3 PDS5A與腫瘤分期的相關性

進一步亞組分析我們觀察了PDS5A基因與胰腺癌分期的相關性，發(fā)現(xiàn)PDS5A與分期無相關性，見圖3。

圖3 PDS5A表達與胰腺癌分期的相關性

2.4 差異基因的GO富集分析

通過篩選PDS5A不同表達組的差異基因，并進行GO富集。我們發(fā)現(xiàn)PDS5A相關差異基因主要富集于消化系統(tǒng)功能相關的AQP5、SPINK1及上皮細胞結(jié)構(gòu)功能相關的MUC6、TFF2等基因上，見圖4。進一步的柱狀圖分析顯示PDS5A基因的表達與這些基因有相關性，其高表達的同時AQP5、SPINK1、MUC6、TFF2表達降低，差異有統(tǒng)計學意義，見圖5。

圖4 PDS5A高低表達組差異基因的GO富集

2.5 PCNA-1(人胰腺癌細胞)、BON-1(人胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤細胞)、HPDE6-C7(胰腺導管上皮細胞)中PDS5A表達

Western blot結(jié)果顯示，PCNA-1細胞中PDS5A的表達高于BON-1及HPDE6-C7細胞，見圖6。

**表示P<0.01；*表示P<0.05

圖6 PDS5A在不同細胞中的表達

3 討 論

染色體不穩(wěn)定和非整倍體形成，即染色體的獲得和丟失，是大多數(shù)惡性腫瘤細胞的特征，發(fā)生在腫瘤形成的早期階段[4]。這種改變可導致細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡的放松調(diào)節(jié)，抑癌基因的缺失和致癌基因的過度表達[5]。PDS5蛋白質(zhì)早熟解離，是一種在姐妹染色單體存在凝聚時表達的核蛋白，與粘蛋白復合物相互作用形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將姐妹染色單體連接在一起，并通過有絲分裂使紡錘體在子細胞之間平均分布[6]。在人類細胞中，PDS5參與穩(wěn)定復制的機制被干擾從而導致DNA出現(xiàn)損傷[7]。因此，PDS5表達缺陷不僅導致染色體錯配和非整倍體出現(xiàn)，而且導致DNA修復缺陷，從而導致有絲分裂細胞死亡和癌變。脊椎動物中有兩種PDS5蛋白，PDS5A和PDS5B，但其功能機制尚不十分明確。

研究表明，在乳腺癌細胞中過表達PDS5A可使G1期細胞數(shù)量增加和caspase-3活化增強，進而導致腫瘤細胞凋亡。此外，與相應的正常組織相比，在乳腺和腎臟腫瘤樣本中觀察到PDS5A mRNA的下調(diào)[8]，而另一項研究報告了在食管、胃、肝臟和橫結(jié)腸腫瘤中PDS5A mRNA水平的上調(diào)。PDS5A在鼻咽癌細胞中的過度表達導致細胞過度增殖，但PDS5A siRNA的表達則減低[2]1-11?？傊@些數(shù)據(jù)表明PDS5A在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有極強組織特異性，不同的細胞和組織類型，可顯示出腫瘤細胞增殖抑制或過度增殖作用。因此本研究旨在探討PDS5A與惡性腫瘤的關系及機制。我們通過GEPIA在線分析軟件分析了在各個惡性腫瘤中PDS5A表達，發(fā)現(xiàn)其在5種腫瘤組織中高表達，且與正常組織相比，差異有統(tǒng)計學意義。同時，我們Western blot的研究顯示PDS5A在胰腺癌細胞中的表達高于正常胰腺細胞。進一步的預后分析表明其與胰腺癌預后指標OS具有相關性，PDS5A高表達組顯示出較差的OS結(jié)局，但與DFS并未顯示出相關性?？紤]其原因可能是可RO切除的胰腺癌患者相對體能較好、分期較早、無轉(zhuǎn)移及血管浸潤，因此這部分患者未表現(xiàn)出DFS的差異。同時有研究顯示，病灶相對局限的胰腺癌最可能通過切除治愈，不過有局限性淋巴結(jié)受累的胰腺癌患者接受完全R0切除后，約有30%也可能長期生存[1]185-191。

研究表明，ⅠA期、ⅠB期、ⅡA期、ⅡB期和Ⅲ期胰腺癌患者的中位生存期分別為38、24、18、17和14個月[9]，這說明胰腺癌分期越晚，預后越差。但遺憾的是我們的分析顯示PDS5A的表達與腫瘤的分期并無相關性，考慮可能與獲取的病理組織分期及特點有關。胰腺癌預后差，初診時往往已經(jīng)因患者病灶廣泛、浸潤血管、遠處轉(zhuǎn)移、體能欠佳失去手術(shù)機會，因此納入的可手術(shù)病理標本往往分期較早，進而導致患者的篩選存在偏倚而無法觀察到與分期的關系。

我們進一步通過對PDS5A高表達組與低表達組差異基因的GO富集發(fā)現(xiàn)，AQP5、SPINK1、MUC6、TFF2等相關差異基因主要富集在消化功能和上皮結(jié)構(gòu)相關功能基因類別上，同時與PDS5A的表達負相關。腫瘤所依賴的各種代謝都需要水分子的參與，而水通道蛋白可以快速特異的轉(zhuǎn)運水分子。AQP5作為水通道家族成員之一，在維持腫瘤細胞滲透壓穩(wěn)定，腫瘤細胞遷移、EMT，腫瘤新生血管形成過程中起到重要作用[10]。SPINK1又被稱為胰腺分泌性胰酶抑制因子，由 56 個氨基酸殘基組成，可抑制胰蛋白酶原活性，拮抗胰腺的“自身消化”。其與胰蛋白酶的比例參與維持胰腺內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。SPINK1 基因突變與慢性胰腺炎的發(fā)生密切相關，而后者則是胰腺癌發(fā)生的危險因子。研究證實，SPINK1 作為腫瘤抑癌基因參與負向調(diào)控腫瘤細胞的侵襲、遷移，進而誘導腫瘤細胞凋亡[11]。MUC 6(黏蛋白 6)作為黏蛋白家族成員之一，由上皮細胞分泌，參與保護黏膜上皮、調(diào)節(jié)細胞黏附等功能，當上皮細胞受損或癌變時異常表達。有研究顯示，粘蛋白相關疫苗可通過激活患者的免疫系統(tǒng)起到抗腫瘤作用[12]。另有研究報道，通過調(diào)節(jié)黏蛋白的表達，可明顯抑制腫瘤進展[13]。FFT2作為三葉因子家族成員之一，具有及保護及修復黏膜、促進腫瘤細胞調(diào)往等功能[14]，所以被認為是抑癌因子。這與我們的發(fā)現(xiàn)基本一致，PDS5A高表達與AQP5、SPINK1、MUC6、TFF2等抑癌基因低表達相關，故認為可導致胰腺癌預后不良。

總結(jié)，染色體不穩(wěn)定和非整倍體形成，是大多數(shù)惡性腫瘤細胞的重要特征，發(fā)生在腫瘤發(fā)展的早期階段。但其在腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展中的具體作用尚不十分清楚。我們的分析表明PDS5A在胰腺癌中的表達與患者預后相關，其高表達提示預后不良。進一步富集分析表明其與消化功能及上皮結(jié)構(gòu)相關基因呈負相關。我們提出假設，其在胰腺癌中的高表達也可能通過這兩方面的功能異常導致腫瘤轉(zhuǎn)移能力及惡性程度增強，進而使患者預后較差。本研究目前主要集中于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫臨床樣本資料的分析并進行了初步的Western blot分析，進一步的研究將在免疫組化及更進一步的細胞實驗驗證相關機制。