利用帶血管骨膜重建腱-骨、腱-假體止點的實驗研究

茹能，梁杰

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院骨科，湖北 宜昌 443000)

臨床上?？梢姷礁鞣N原因引起的關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍骨組織破壞，關(guān)節(jié)周圍的腱性組織喪失了正常的腱-骨附著點，導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動障礙的病例，尋找一種簡單有效的修復(fù)方式成為骨科修復(fù)領(lǐng)域的難題。目前在治療骨缺損、修補腱-骨止點的手術(shù)方法中，骨膜移植已成為臨床最佳選擇方法[1]。其優(yōu)點為骨膜質(zhì)地軟易于成形，便于原位切取、不需要增加額外損傷，對供區(qū)傷害小等。因此，本實驗探討能否利用游離骨膜在修復(fù)骨缺損的同時重建腱-骨止點，能否利用游離骨膜在內(nèi)植物假體表面原位建立腱-骨-假體連接的可能性。

1 資料與方法

1.1 實驗對象 本研究實驗對象為30只兔齡在18周齡新西蘭大白兔，雌雄不限，體重2.5～3.5 kg。

1.2 動物模型及手術(shù)方法 隨機挑選實驗兔2只，取雙側(cè)上肢做為正?？瞻讓φ战M。余下28只隨機分為A、A1、B、B1組，分別選取左、右上肢顯露肱二頭肌肌腱在橈骨上端止點切斷，游離尺動脈，尺動脈較為恒定的在鷹嘴下1.2～1.5 cm處發(fā)出一支粗大的骨膜支長入骨膜，以穿入點為中心切取骨膜面積為1.0 cm×0.8 cm。咬除橈骨骨組織，制造不低于0.5 cm的骨性缺損。骨斷端以人指骨內(nèi)固定鈦板固定，采用4種不同方法修復(fù)。A組：將肌腱斷端置于缺損處中央，取帶尺動脈的尺骨后外側(cè)骨膜瓣，包裹缺損部及肌腱斷端并縫合固定。A1組：將肌腱止點斷端縫合于骨缺損處骨組織斷端，不以游離骨膜覆蓋。B組：將肌腱止點縫合于鈦板上，骨膜瓣包裹骨缺損及鈦板-肌腱止點縫合處。B1組：將肌腱止點斷端縫合于內(nèi)固定鈦板上，不以游離骨膜覆蓋。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 透視觀察 術(shù)后6周、12周進行X線透視觀察，按Lane-Sandhu X射線評分標(biāo)準(zhǔn)從成骨程度、連接程度、骨髓腔改建程度3方面進行評分(見表1)。

1.3.2 鏡下觀察 術(shù)后6周和12周樣本切片后行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)鏡下觀察，檢測指標(biāo)為：(1)HE染色細(xì)胞密度的計數(shù)；(2)腱長入厚度；(3)腱-骨止點周圍毛細(xì)血管計數(shù)。

1.3.3 細(xì)胞因子測定 以腱-骨結(jié)合部免疫組化染色積分光密度(integral optical density，IOD)檢測骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)表達量。

1.3.4 生物力學(xué)測試 樣本固定于生物力學(xué)試驗機，肱二頭肌肌腱與橈骨骨干呈20°進行拉力測試，先行上下循環(huán)負(fù)荷加載，加載區(qū)間為10～80 N，拉力達到2.0 N時用電子游標(biāo)卡尺測量腱-骨止點橫截面積，然后按0.5 mm/s拉伸速度行拉斷實驗，比較各組腱-骨界面的抗拉強度。

2 結(jié) 果

2.1 透視觀察 A、B兩組6周后有明顯骨痂生成，12周后骨缺損處已恢復(fù)骨連續(xù)性，A1、B1組透視12周后僅1份標(biāo)本可見骨痂連續(xù)，其余均為骨不連。按Lane-SandhuX射線評分標(biāo)準(zhǔn)進行評價，見表2。

2.2 HE染色鏡下觀察 A組6周后見腱-膜組織交界處不規(guī)則鈣化斑，骨母細(xì)胞較多，12周后未見“潮線”樣結(jié)構(gòu)，成熟骨細(xì)胞數(shù)量多于骨母細(xì)胞，未見直接愈合的典型4級結(jié)構(gòu)形成。A1組6周后鏡下骨母細(xì)胞數(shù)量少于A組，鈣化斑密度低于A組，12周成熟骨細(xì)胞數(shù)量和骨母細(xì)胞較6周時增多，但少于同期A組(見圖1～2)。B組6周鏡下見腱-假體-骨膜界面結(jié)合部瘢痕組織和增生的肌組織增生，骨膜內(nèi)置物側(cè)未見鈣化影，12周鏡下見內(nèi)植物-骨膜界面骨膜下骨母細(xì)胞數(shù)量增多，部分纖維組織與腱組織相互長入，無sharpey樣纖維結(jié)構(gòu)形成。內(nèi)植物側(cè)骨膜下極少鈣化骨組織(見圖3)。B1組肌腱止點均斷裂，在本實驗中無觀測意義，予以剔除。鏡下統(tǒng)計A組、A1組、B組成熟骨細(xì)胞和骨母細(xì)胞數(shù)量、毛細(xì)血管數(shù)量及腱-骨長入厚度作對比(見表3)。

表1 Lane-Sandhu X射線評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 Lane-Sandhu X射線評分分)

成熟骨細(xì)胞計數(shù)：6周后A、A1組比較t=14.74，P<0.01；B、A1組比較t=21.83，P<0.01；A、B組比較，t=30.31，P<0.01。12周后A、A1組比較t=16.73，P<0.01；B、A1組比較t=31.34，P<0.01；A、B組比較，t=38.72，P<0.01。骨母細(xì)胞計數(shù)：6周后A、A1組比較t=7.25，P<0.01；B、A1組比較t=7.86，P=0.01；A、B組比較t=2.26，P>0.05。12周后B、A1組比較t=10.23，P<0.01；A、B組比較t=11.82，P<0.01；A、A1組比較t=1.52，P=0.11。毛細(xì)血管數(shù)量：6周后A、A1組比較t=4.25，P=0.01；B、A1組比較t=6.93，P<0.01；A、B組比較t=2.26，P>0.05。12周后A、A1組比較t=5.40，P=0.01；B、A1組比較t=5.96，P<0.01；A、B組比較t=1.23，P=0.15。

a A組6周切片 b A1組6周切片

a A組12周切片 b A1組12周切片

a B組6周切片 b B組12周切片

A、B組毛細(xì)血管數(shù)量、腱-骨長入厚度顯著高于A1組(P<0.01，見表3～4)。6周后A、A1組比較，t=11.49，P<0.01；B、A1組比較t=13.19，P<0.01；A、B組比較t=1.23，P=0.15。12周后A、A1組比較t=11.89，P<0.01；B、A1組比較t=12.01，P<0.01；A、B組比較t=1.69，P=0.09(見圖4～7)。

2.3 BMP和bFGF染色IOD值測定 比較發(fā)現(xiàn)A、B組6周時BMP和bFGF染色IOD值顯著高于A1組(P<0.01)，A、B兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。12周時A、B組IOD仍高于A1組(P<0.05)，A、B兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表5～6)。BMP染色IOD值：6周A、B組比較，t=0.751，P=0.47；B、A1組比較，t=29.371，P<0.01；A、A1組比較，t=28.268，P<0.01。12周A、B組比較，t=-1.322，P=0.22；B、A1組比較，t=7.398，P<0.01；A、A1組比較，t=5.774，P<0.01。bFGF染色IOD值：6周A、B組比較，t=0.226，P=0.83；B、A1組比較，t=9.296，P<0.01；A、A1組比較，t=9.357，P<0.01。12周A、B組比較，t=0.674，P=0.52；B、A1組比較，t=5.622，P<0.01；A、A1組比較，t=5.243，P<0.01。

表3 3組腱-骨止點細(xì)胞密度比較

表4 3組腱-骨長入厚度對比

圖4 3組成熟骨細(xì)胞計數(shù)比較

圖5 3組骨母細(xì)胞計數(shù)比較

圖6 3組毛細(xì)血管數(shù)量比較

圖7 3組腱-骨長入厚度比較

表5 BMP染色IOD值

表6 bFGF染色IOD值

2.4 生物力學(xué)測試 B1組不能進行力學(xué)測試，予以剔除。6周樣本中抗拉強度正常對照組>A=B>A1；12周后抗拉強度正常對照組>A>B>A1組(見表7，見圖8)。最大載荷：6周A、A1組比較，t=7.38，P<0.01；B、A1組比較，t=7.22，P<0.01；A、B組比較，t=0.18，P=0.35。12周A、A1組比較，t=13.45，P<0.01；B、A1組比較，t=4.99，P<0.01；A、B組比較，t=8.12，P<0.01。腱-骨結(jié)合部面積：6周A、A1組比較，t=1.96，P=0.07；B、A1組比較，t=1.58，P=0.10；A、B組比較，t=0.79，P=0.24。12周A、A1組比較，t=4.69，P<0.01；B、A1組比較，t=6.05，P<0.01；A、B組比較，t=1.95，P=0.07?？估瓘姸龋?周A、A1組比較，t=12.21，P<0.01；B、A1組比較，t=15.22，P<0.01；A、B組比較，t=1.07，P=0.18。12周A、A1組比較，t=20.31，P<0.01；B、A1組比較，t=2.93，P=0.03；A、B組比較，t=27.69，P<0.01。

圖8 3組抗拉強度對比分析

表7 3組腱-骨止點生物力學(xué)對比

3 討 論

3.1 游離骨膜瓣對骨缺損愈合的影響 從表2可見，A、B兩組缺損處的骨愈合速度、骨缺損愈合率遠(yuǎn)高于A1、B1組，帶血供的骨膜能有效修復(fù)小段骨缺損。考慮骨內(nèi)膜為缺損部提供了大量的間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨母細(xì)胞，骨母細(xì)胞分泌基質(zhì)，促進鈣沉積。而帶血管蒂的骨膜瓣具備完整的動脈供血系統(tǒng)及靜脈回流系統(tǒng)，血供充足，局部氧分壓高；在用骨膜包裹肌腱、缺損部縫合時使其成為高張力狀態(tài)；良好血供、高氧分壓與高張力因素促進骨母細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞分化[2，3-4]，修復(fù)骨缺損。

3.2 游離骨膜瓣和內(nèi)植物對腱-骨止點骨細(xì)胞、骨母細(xì)胞數(shù)量的影響 腱-骨愈合有直接愈合和間接愈合兩種方式[5]，直接腱-骨愈合是形成具有4層“潮線”結(jié)構(gòu)特點的腱-骨連接，而間接愈合是肌腱-骨之間被大量肉芽、成纖維組織包裹，最后改造、塑性形成Sharpey樣纖維而達到連接[6-7]，但該類愈合時間很長，有報道需要12個月以上[8]。直接愈合與局部成熟骨細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)，只有成熟骨細(xì)胞才能形成鈣質(zhì)，為肌腱附著提供堅強的“錨定界面”[9-10]。骨母細(xì)胞體積較小，位于骨質(zhì)表面，可分化為體積較大、染色較深的成骨細(xì)胞，成熟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)和纖維并逐漸被骨質(zhì)包裹，移行于其中。由表3及圖4～5可見，A組成熟骨細(xì)胞數(shù)量始終多于其他組，6周A組骨母細(xì)胞與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，12周則明顯少于B組，說明B組骨母細(xì)胞在繼續(xù)分化為骨細(xì)胞時受阻?？紤]是因為A組中骨母細(xì)胞微環(huán)境合適，骨母細(xì)胞更易于在周圍沉積鈣質(zhì)和膠原并向成熟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化；而B組骨膜瓣血供雖良好，但鈦板表面環(huán)境阻礙了骨母細(xì)胞分泌基質(zhì)、鈣沉積過程，抑制了骨母細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，故而引起骨母細(xì)胞數(shù)量隨時間推移逐漸增多，骨膜增厚，骨細(xì)胞數(shù)量卻極少。我們分析，對骨膜不能在鈦內(nèi)植物表面成骨的機制不完全明了，可能與下列因素有關(guān)：(1)鈦板光滑的表面不能為增殖的骨細(xì)胞提供黏附的空間支架結(jié)構(gòu)，骨細(xì)胞在有限的空間增殖后抑制了骨膜間充質(zhì)細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。(2)普通鈦內(nèi)植物表面不能形成富含各種成骨生長因子的微環(huán)境。(3)鈦的組織相容性強，對機體刺激性小，引起的局部炎性反應(yīng)弱，局部各種炎性因子含量低，而炎性因子能影響多種骨生長因子的分泌。本次實驗給予的腱-骨愈合時間較短，文獻報道完全形成骨性愈合時間需6～12個月[7，11]，因此未觀察到腱-骨連接復(fù)合體。但對比未用骨膜覆蓋的A1組，游離骨膜移植可顯著增加成熟骨細(xì)胞數(shù)量，加快鈣質(zhì)形成速度。B組的實驗結(jié)果一方面證明了附著界面對腱止點愈合的重要性，同時也證明了游離骨膜能夠與肌腱形成間接連接，能達到間接愈合。

3.3 游離骨膜瓣對腱-骨止點血供建立及腱-骨長入厚度的影響 重建良好的血液供應(yīng)對促進腱-骨愈合非常必要[12]。豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)提供給肌腱殘端良好血供，有助于肌腱末端血供系統(tǒng)再生，從而促進腱組織的“自愈合能力”[13]。表2中通過毛細(xì)血管計數(shù)對比發(fā)現(xiàn)，帶骨膜瓣的A、B組對恢復(fù)重建止點部位微循環(huán)有顯著促進作用。B1組實驗結(jié)果表明，單純依靠肌腱的“自愈合能力”不能在3個月的時間內(nèi)形成腱-內(nèi)植物的有效連接，肌腱短期內(nèi)即可因腱遠(yuǎn)端壞死而使重建失敗，也不能依靠周圍的軟組織重建局部循環(huán)。

腱-骨長入厚度是評價腱-骨愈合程度及影響腱-骨愈合強度最重要的指標(biāo)之一[14]。包裹肌腱止點的成骨細(xì)胞使腱-骨止點有充分的接觸面積，肌腱和骨組織更易于相互長入，此過程被學(xué)者稱為“腱-骨整合過程”，是腱-骨堅強愈合過程的重要一步[15]。A組12周時已可見部分腱-骨組織重塑，而腱-骨愈合的本質(zhì)，就是肌腱與骨組織各種因素作用下相互長入、重塑，形成牢固纖維連接或骨性連接的過程。對骨膜的張力性縫合起到了細(xì)胞支架作用，使新生骨及肌腱能夠通過支架生長，恢復(fù)了骨缺損原有腱-骨解剖結(jié)構(gòu)。

3.4 游離骨膜對細(xì)胞因子BMP、bFGF的影響 已證實BMP和bFGF有誘導(dǎo)局部未分化細(xì)胞向成骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加強成骨細(xì)胞功能的作用[16-17]。表5～6可見A、B組上述兩組細(xì)胞因子的表達對比A1組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其來源為：(1)游離骨膜本身就具有完整的血供系統(tǒng)，含毛細(xì)血管網(wǎng)、纖維結(jié)締組織和成纖維細(xì)胞，bFGF即由成纖維細(xì)胞分泌。(2)游離骨膜促進了肌腱斷端毛細(xì)血管網(wǎng)的重建，損傷的肌腱細(xì)胞和腱鞘中的成纖維細(xì)胞也大量分泌bFGF。(3)止點周圍肉芽組織分泌bFGF。(4)游離骨膜中的多功能間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞，BMP主要由骨細(xì)胞、骨母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌。分泌的BMP促進更多骨細(xì)胞成熟，其含量進一步增多[18-19]。(5)骨膜細(xì)胞自身表達BMP。

正常骨組織并不表達BMP，一旦骨組織損傷，骨細(xì)胞中BMP被迅速激活，參與骨修復(fù)，一旦修復(fù)完成，則其表達再次靜止[20]。這也解釋了A、B組在12周后樣本中BMP含量較6周時降低的現(xiàn)象。與BMP相似，bFGF含量也在修復(fù)完成后逐漸下降。A1組中因為修復(fù)未完成，BMP和bFGF持續(xù)表達，含量逐漸增高。

3.5 游離骨膜對腱-骨生物力學(xué)的影響 對各組的生物力學(xué)測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6周時A、B組最大載荷和抗拉強度無明顯差別，均為正?？瞻讓φ战M的37%左右，而12周后A組明顯高于B組，說明后期隨著A組骨、腱組織的重塑改建完成，直接愈合的強度優(yōu)于間接愈合，能在更早時間內(nèi)接受更大的功能活動鍛煉。正常的腱-骨骨性連接所具備的腱組織-非鈣化軟骨-鈣化軟骨-骨復(fù)合結(jié)構(gòu)是一個逐層緩沖結(jié)構(gòu)，能夠?qū)?yīng)力逐層分散遞減承擔(dān)，避免了應(yīng)力集中而使得腱-骨止點承受更大拉力，完成直接愈合達到正常腱-骨止點強度的過程需要長于24周的時間[20-21]。有文獻報道骨性腱-骨愈合過程中典型“潮線”結(jié)構(gòu)形成時間需1年左右，同時肌腱完全韌帶化的時間需10余月[22]，A組肌腱止點雖然被骨性組織包裹，并在其中長入、重塑，但并未達到完全愈合時間，因此A組腱-骨愈合強度弱于正常對照組。12周后B組抗拉強度為正常47%，高于A1組35%，比較后證明，即使單純利用帶血管游離骨膜通過間接連接方式修復(fù)腱-骨止點的抗拉強度，也優(yōu)于使用傳統(tǒng)修復(fù)方式的A1組。間接腱-骨愈合的標(biāo)志是形成Sharpey樣纖維，此結(jié)構(gòu)能夠有效將應(yīng)力分散到骨面上，以對抗更強的拉力，但其過程也耗時頗長，有的實驗甚至在14個月后才觀察到該纖維形成[23-24]，但通過該實驗證明游離骨膜能為腱-骨間接愈合提供更有利的條件。

綜上所述，針對關(guān)節(jié)周圍腱-骨缺損修復(fù)目前的常用方法為游離骨移植修復(fù)骨缺損，再行腱-移植骨止點重建。但其缺陷顯而易見：操作步驟增多導(dǎo)致手術(shù)時間長、感染概率增大、手術(shù)創(chuàng)傷增加、供區(qū)骨組織永久缺損等。因此，尋找一種新的修復(fù)重建方法成為大家關(guān)注的熱點。利用帶血管系統(tǒng)的游離骨膜直接修復(fù)關(guān)節(jié)周圍的骨缺損并同時重建腱-骨、腱-假體止點的相關(guān)研究較少，尤其是在重建后對其生物力學(xué)的研究方面。在實驗動物學(xué)方面，選擇兔肱二頭肌肌腱橈骨止點模擬腱骨止點缺損并利用帶尺動脈游離骨膜瓣修復(fù)的建模方法也未見相關(guān)文獻報道。本實驗利用帶血管骨膜重建關(guān)節(jié)周圍骨缺損部位腱-骨、腱-假體止點的實驗研究有極強的臨床針對性，在關(guān)節(jié)外科、創(chuàng)傷骨科及運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有應(yīng)用價值，為臨床骨缺損修復(fù)，重建腱-骨、腱-假體止點提供了一種新的治療選擇。